[发明专利]一种提高由三孢布拉氏霉菌生产番茄红素产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种提高由三孢布拉氏霉菌生产番茄红素产量的方法，属于通过添加一系列前体物质来提高微生物液体发酵生产次级代谢产物的研究领域，特别涉及到一种通过添加异戊烯醇、香叶醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇和甲羟戊酸内酯来提高番茄红素的生物合成量的方法。 

背景技术

番茄红素是一种脂溶性的不饱和碳氢化合物，属于异戊二烯类化合物，具有11个共轭双键和2个非共轭双键，分子式为C40H56，分子量为536.85Da，分子结构如下： 

番茄红素是一种重要的脂溶性类胡萝卜素，具有很强抗氧化、清除自由基、抗癌抑癌、增强机体免疫、延缓衰老和预防心血管疾病等重要的生理功能，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。对于番茄红素的生产方法，除了天然提取或化学合成外，还可以采用藻类和真菌及酵母发酵生产类胡萝卜素，是获得生物资源型类胡萝卜素的最重要的途径，不受环境条件限制，具有安全性、低成本及强着色力等优势在国内外受到格外的青睐。从品质、技术、生产、资源成本等分析，利用微生物技术生产番茄红素等天然类胡萝卜素是发展的主要方向。目前，利用三孢布拉氏霉发酵生产番茄红素已经达到半工业化程度。但是目前制约发酵法工业化生产番茄红素的主要因素是微生物不能高水平的积累番茄红素，导致发酵产率低、生产成本较高。番茄红素合成途径复杂，构建番茄红素基因工程高产菌至今尚未取得突破性进展。因此，添加前体物质及发酵促进剂，并且对发酵条件进行优化，仍是提高番茄红素产量的主要手段。 

在用三孢布拉氏霉生产番茄红素的过程中，我们发现添加一系列的中间代谢产物的结构类似物(异戊烯醇、香叶醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇和甲羟戊酸内酯)能够明显提高微生物的生物量和番茄红素的产量。 

番茄红素可由微生物三孢布拉氏霉发酵通过类异戊二烯代谢途径合成，合成前体是由乙酰辅酶A衍生而来的，乙酰辅酶A经过一系列反应生成甲羟戊酸， 进一步在质体中生成异戊烯焦磷酸(IPP)，异戊烯焦磷酸经异构化生成二甲基丙烯焦磷酸(DMPP)，两分子二甲基丙烯焦磷酸缩合生成牦牛儿焦磷酸(GPP)，然后经法尼基焦磷酸(FPP)生成牦牛儿基牦牛儿焦磷酸(GGPP)，经八氢番茄红素、ζ-胡萝卜素生成番茄红素。番茄红素可以在环化酶的作用下转变成β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄素、紫黄质、新黄素等类胡萝卜素。在发酵过程中，在适当时间添加阻断剂，使番茄红素不过进一步转化为其它类胡萝卜素，这样就可以使番茄红素积累起来，在发酵之后，进行细胞破碎就可获得产物。 

已有的研究表明，初级代谢中间产物柠檬酸、乌头酸、苹果酸和琥珀酸对番茄红素的合成均有一定的促进作用。由发酵相关的理论可知，在发酵过程中适当添加中间代谢产物，如GPP、IPP、DMAPP、GGPP，甲羟戊酸(溶于水易内酯化，所以购买的甲羟戊酸内酯)，可以达到刺激代谢流向番茄红素积累的方向流动，促进番茄红素的提高。在实验中我们发现异戊烯醇是IPP的结构类似物，3-甲基-3-丁烯-1-醇是DMAPP的结构类食物，香叶醇是GPP和GGPP的结构类似物，添加这些结构类似物同样可以起到提高番茄红素产量的目的。GPP、IPP、DMAPP、GGPP这些中间代谢物不稳定，而且市场上很难买到，不可以直接用来添加，也就达不到提高番茄红素产量的目的。而异戊烯醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、香叶醇性质稳定，可以方便购买，成本很低，可以应用于工业化生产番茄红素的生产中。 

发明内容

本发明的目的在于提供三孢布拉氏霉菌液体发酵深层发酵生产番茄红素的产量。具体实施方法是以Blakeslea trispora(+)(-)为发酵菌种，种子单独培养40-44h后，正负菌按比例混合接入发酵培养基进行发酵培养，在合适的时间分别加入一定浓度的中间代谢产物的结构类似物，然后加入烟碱阻断剂，发酵培养120h后结束，然后进行菌丝体中番茄红素的提取与纯化等工艺过程。本发明提供了一种提高由三孢布拉氏霉生产番茄红素产量的方法，其特征在于：本发明的具体的技术路线包括如下步骤： 

菌种来源 

产生番茄红素的菌种是三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)，一种丝状真菌，隶属于毛霉目(Muco-rales)，笄霉科，布拉霉菌属(Blakeslea)，分“+” “-”两种菌株，购买于美国模式培养物集存库(ATCC)，菌号为14271(+)和14272(-)。 

(1)平板培养