[发明专利]一种新的检测稗草对二氯喹啉酸抗药性的方法

说明书

技术领域

本发明属于利用基因片段或序列进行杂草抗药性检测领域，特别地，属于利用稗草对二氯喹啉酸抗药性的基因片段以及引物来检测稗草对二氯喹啉酸抗药性以及利用这些基因检测抗药性的方法。

背景技术

截止2011年5月全球已有197种杂草(115种双子叶，82种单子叶)的358个生物型对19类化学除草剂产生了抗药性，几乎涵盖各类重要的除草剂。抗药性杂草已成为杂草治理和农业生产的严重威胁，由其引发的严重经济和安全问题倍受全球关注。

稗草(Echinochloa crusgalli)是世界性的稻田恶性杂草，是我国农田15种严重危害杂草之首。而1988年德国巴斯夫公司开发的二氯喹啉酸(Quincloric)是防除稗草等禾草的特效药，自1990在我国推广使用以来，防效显著，但是，由于十多年连续使用，在我国南北稻区逐渐出现抗药性稗草，而且日趋严重。抗药性稗草的漫延和猖獗带来了许多负面效应，如降低生物多样性、增加农药的投入，污染作物的产地环境，降低水稻的产量和品质等。

GH3(Gretchen Hagen 3)基因最早是从大豆中克隆出的植物生长素早期响应基因(Primary-response genes)，后来在拟南芥(有19个GH3家族成员)、水稻(有13个GH3的类似基因)，烟草(至少1个GH3基因)，辣椒(1个GH3基因))，印度芥菜(有2个GH3的类似基因)及苔藓植物P.patens(有3个GH3家族成员)中发现许多GH3基因或其类似基因，有的GH3以基因家族的形式存在，例如在拟南芥基因组中，在第5条染色体上有5个GH3基因，而且这些基因方向一致地串联排列在一起。生长素能够诱导GH3基因家族中的大部分基因快速、瞬时地表达。这种快速应答是调节植物体内生长素动态平衡的机制之一。植物GH3蛋白具有IAA等植物生长素氨基酸化合成酶和腺苷化合成酶活性。

快速、准确、高通量的杂草抗药性检测方法，是抗药性杂草防治的一个关键环节。目前杂草抗药性检测方法主要有(1)、温室整株植物鉴定法。它是国际杂草抗药性管理组织推荐的一种主要技术，优点是简便易行，重复性好。缺点是温室空间大，试验周期长、不能对当季杂草作鉴定。(2)、组织或器官的形态结构比较鉴定法，包括种子或幼苗检测法、分蘖检测法、花粉粒萌发法、叶圆片浸渍技术测定等，其优点是简便易行，缺点是不准确。(3)、细胞或细胞器水平测定，包括叶片内叶绿素荧光测定法、离体叶绿体测定技术、光合速率测定法，优点是准确，缺点是复杂、对技术和设备要求高。(4)、生理生化鉴定法，主要是酶活性测定法，缺点是：只适合靶标酶已知的杂草。(5)、DNA分析技术鉴定法，主要是靶标基因序列的突变位点比较。缺点是，只适合靶基因突变的杂草。(6)、蛋白质水平的鉴定法，主要是ELISA法对抗性杂草的特异蛋白质的检测。缺点是，只适合已知特异蛋白质的抗药性杂草。

标志基因法检测杂草抗药性优势明显，首先它可实现大规模、高能通量的样品量检测，因而可迅速掌握大面积农田的杂草抗药性水平和范围。其次对当季稻田发生的杂草草实现检测，掌握其抗药性水平。第三是检测周期短、出结果快，只需要几天便可得结果。其缺点是对仪器要求较高，荧光定量PCR仪是较贵。

发明内容

一个标志基因只能检测一种或一类农药的杂草抗药性。所以挖掘农药的标志基因是发展和完善标志基因法的必由之路。农药的标志基因应该具备：在不同抗药性水平的杂草植株中，标志基因在转录水平的表达量存在差异，这种差异是区分杂草抗药性的定量指标，而且其表达量和抗药性水平存在较好的线性关系。为了进一步验证结果的准确性。标志基因还应该有其它的特征，比如在对应农药处理杂草后，在不同抗药性水平的杂草植株中，标志基因有不同的表达特征。

本发明小组人员提出了通过检测标志基因在转录水平的表达量是一种新的杂草抗药性检测方法。GH3基因是植物生长素储存代谢基因，在维持细胞内正常生长素浓度方面起重要作用。本发明小组从抗二氯喹啉酸稗草克隆了GH3基因的同源基因并命名为ec-GH31。ecGH31基因名称中，按国际命名习惯EC是稗草拉丁文Echinochloa crusgalli的首字母缩写。GH3是来自稗草的与GH3基因同源的基因，1指稗草的GH3基因家族中克隆的第一个基因。

它在抗、感二氯喹啉酸稗草植株体内的表达量明显不同，用二氯喹啉酸处理防治适期的抗、感稗植株后，具有明显不同的表达曲线。以上特征使GH3基因成为检测稗草抗二氯喹啉酸水平的标志基因，为建立一种杂草抗药性检测新方法提供了可能。