[发明专利]MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法

权利要求书

1.MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法，包括如下步骤：

①选取40～45株霍乱弧菌新鲜培养物，进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理；

②采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱；

③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱；

④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；

⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；

⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤①选择的霍乱弧菌共42株，分别是O1群霍乱弧菌23株、O139群霍乱弧菌11株、非O1/非O139群霍乱弧菌8株。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤①的预处理方法是：取霍乱弧菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL 70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行图谱采集，仪器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤⑥根据匹配分数判定检测结果的标准为：

当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；

当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；

当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；

在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。

6.权利要求1所述的方法，包括如下步骤：

①选取O1群霍乱弧菌23株、O139群霍乱弧菌11株和非O1/非O139群霍乱弧菌8株的霍乱弧菌新鲜培养物进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理：取霍乱弧菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测；

②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱，器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da；

③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱；

④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；

⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；

⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数按照下述原则判定检测结果：

当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；

当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；

当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；

在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。

7.建立MALDI-TOF MS霍乱弧菌标准图谱的方法，包括权利要求1的步骤①～③。

8.权利要求7的方法建立的霍乱弧菌标准图谱。