[发明专利]MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及霍乱弧菌的检测新方法，尤其是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)辅助鉴定的方法。

背景技术

在霍乱弧菌是烈性肠道传染病——霍乱的病原菌，霍乱发病急、传播快，主要症状为剧烈的腹泻和呕吐，可引起严重脱水、周围循环衰竭和急性肾衰，治疗不及时易死亡。目前已发现霍乱弧菌有200多种血清型，据报道只有O1和O139两种血清型能引起霍乱的暴发流行(Epidemiology，genetics，and ecology of toxigenic Vibrio cholora，Mol.Biol.1998.Rev.62：1301-1314.)。霍乱弧菌广泛存在于河水、湖水以及海水中，甚至存在于牡蛎、海蟹、河蟹等水生动物的体表和体内，是水生环境中的正常栖息菌。

对霍乱弧菌的检测主要是以分离培养进行鉴定，但这些传统的检测方法费时费力，诊断血清昂贵。人们不断地开展快速检测技术的研究，建立了很多基于核酸的快速检测方法，如PCR法、实时PCR法等，这些方法在霍乱弧菌的快速检测中发挥了很大作用。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近几年快速发展起来的应用于细菌快速检测的一项新技术，是一种新型的软电离生物质谱。它通过测得待测微生物的蛋白质指纹谱图，通过Biotyper软件对这些指纹谱图进行处理，并和数据库中已知微生物的标准指纹图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。在操作上制样简便、可微量化、高度自动化，已越来越多地用于微生物的检测与鉴定，特别是在细菌耐药性分型研究方面有很多报道。该技术的局限性是依赖于数据库的资源是否充足(Rapid typing of bacteria using matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry and pattern recognition software.J Microbiol Methods 2002；48：127-38.)。然而，针对具体微生物的检测，该技术在应用的普及方面存在可依赖的数据库的资源不足的问题，目前，Biotyper数据库非常缺乏霍乱弧菌的特征谱图。因此，迫切需要创建霍乱弧菌鉴定质谱图数据库并建立以此为基础的霍乱弧菌检测方法，并进一步开展MALDI-TOF-MS对霍乱弧菌分型和主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)研究。

发明内容

本发明的目的之一在于提供MALDI-TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法，包括如下步骤：

①选取40～45株霍乱弧菌新鲜培养物，进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理；

②采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱；

③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为霍乱弧菌标准图谱；

④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；

⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；

⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的霍乱弧菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。

上述本发明的方法中所述的步骤①选择的霍乱弧菌共42株，分别是O1群霍乱弧菌23株、O139群霍乱弧菌11株、非O1/非O139群霍乱弧菌8株。

上述本发明的方法中所述的步骤①的预处理方法是：取霍乱弧菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测。

本发明的上述方法中所述的步骤②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行图谱采集，仪器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da。