[发明专利]一种超低分子肝素钠的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种超低分子肝素钠(Ultra LowMolecular Weight Heparin，ULMWH)的制备方法。

背景技术

低分子肝素是从普通肝素通过降解得到的小分子肝素制品，具有生物利用率高、血浆半衰期长等优点，特别是其引起的出血副作用大幅降低。从普通肝素到低分子肝素的降解方法较多，目前采用的降解方法主要有亚硝酸降解、β-消除降解法、过氧化物降解法以及肝素酶降解。

超低分子肝素是在低分子肝素基础上进一步纯化分离得到的肝素衍生品，其平均分子量小于3000Da。与低分子肝素相比，超低分子肝素具抗凝作用安全，其抗血栓作用强，皮下注射易吸收，主要用于血栓栓塞性疾病的预防，如肾病综合症，手术后静脉血栓的形成、老年静脉血栓和心脑血管疾病的预防以及防治高血脂症等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种超低分子肝素钠的制备方法，该制备方法降解条件温和可减少磺酸基从肝素上的脱落，通过该方法制备的超低分子肝素钠平均分子量小于3000Da，具有高抗Fxa生物活性。

本发明所采用的技术方案如下：

一种超低分子肝素钠的制备方法，包括如下步骤：

(1)取精品肝素配成10％的水溶液，室温下边搅拌边加入季铵盐如苄索氯铵，1～2小时后停止搅拌，沉降、倾倒、洗涤沉淀物，最后过滤、干燥，得到白色肝素季铵盐固体；

(2)将(1)中的肝素季铵盐固体溶解于有机溶剂中配成5％～10％的溶液，加入与肝素季铵盐等量的氯化苄，30℃～35℃下，搅拌反应24小时后，冷至室温，加入2倍体积的10％醋酸钠/甲醇溶液，搅拌30分钟后，静止沉淀，过滤，甲醇洗涤，室温下真空干燥，得到肝素的酯化物；

(3)将(2)得到的肝素酯化物溶于10倍的水中配成溶液，将2.3～2.5倍的酯化物量的苄索氯铵溶于10倍的水中，完全溶解后，室温、剧烈搅拌下将此溶液慢慢加入到肝素酯化物的水溶液中；添加完成后，继续搅拌1-2小时，然后停止搅拌；待白色固体沉降后，倾去上层清夜，加水洗涤，过滤，再洗涤，然后真空下干燥(不高于50℃)，得到肝素酯化物的季铵盐；

(4)将(3)得到的肝素酯化物的季铵盐溶于10倍的有机溶剂中，待溶解后，加入0.05～0.2摩尔浓度的碱如苄基三甲基氢氧化铵、DBU(二氮杂二环)、或甲醇钠，在温度为0℃～50℃(优选10℃～40)下反应4～24小时(优选8～12小时)进行β-消除降解；

(5)将(4)反应结束后的降解物，在室温下加入两倍体积的10％的醋酸钠的甲醇溶液，搅拌1～2小时后，在0℃～4℃下沉降、过滤、甲醇洗涤，在25℃～35℃下真空干燥，得到低分子肝素钠的粗品；

(6)上述(5)中的低分子肝素钠粗品配成10％的溶液，0℃～4℃下加入氢氧化钠溶液，调pH在9～10，并在此温度下反应3小时；而后用1M盐酸中和，加入氯化钠至盐度为8～10％，用3倍的甲醇沉淀，沉淀物用甲醇洗涤，真空干燥；

(7)上述(6)中的低分子肝素钠粗品配成10％的溶液，1M氢氧化钠溶液，调pH值为9～10，加入30％的过氧化氢搅拌6小时后，滴加1M的盐酸至中性，然后加入8～10％的氯化钠，再用2.5～3倍的甲醇沉淀低分子肝素钠；过滤，用甲醇洗涤后干燥制得低分子肝素钠的精品；

(8)上述(7)中得到的精品低分子肝素通过含ATIII填料柱，以0.15M的氯化钠/0.05M Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶液(pH＝7.4)为淋洗剂，洗去杂质和活性低的分子，然后以1.0M的氯化钠/0.05M Tris溶液(pH＝7.4)溶液为洗脱剂，将超低分子肝素从柱子上洗脱，得到的洗脱液用3倍的甲醇沉淀，过滤，甲醇洗涤，真空干燥；

(9)将上述(8)得到的产物溶于水配成10％的溶液后，添加氯化钠至浓度为10％，用3倍体积的甲醇沉淀，过滤，甲醇洗涤，真空干燥得到超低分子肝素钠精品；

(10)将上述(9)得到的精品超低分子肝素钠溶解于去离子水配成10％的溶液，用0.2微米的膜过滤后，冷冻干燥，最终得到超低分子肝素钠，其抗FXa效价在160～220IU/mg，抗FIIa效价在0.5～4IU/mg，平均分子量在2000～3000Da。

作为本发明进一步的改进，上述超低分子肝素钠制备方法中步骤(4)所述有机溶剂为二氯甲烷或二甲基甲酰胺。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：