[发明专利]一种胃癌治疗疗效判断的方法、试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种判断胃癌治疗疗效的方法：检测胃癌组织中miR-21和/或miR-181b表达水平。

2.一种判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成：RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒和实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒能检测出胃癌组织中miR-21和miR-181b的含量。

3.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有Trizol试剂、氯仿、异丙醇、显色剂、乙醇和无核酸酶水。

4.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有Trizol试剂0.8-1.2ml、氯仿500-700ul、异丙醇400-600ul、显色剂0.5-2ul、75％乙醇0.5-2ml和无核酸酶水5-20ul。

5.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有Trizol试剂1.05ml、氯仿600ul、异丙醇500ul、显色剂1ul、75％乙醇1ml和无核酸酶水10ul。

6.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RT-PCR试剂盒含有dNTPs，逆转录酶，逆转录缓冲液，RNA酶抑制剂，miR-21和/或miR-181b特异性逆转录引物和无核酸酶水。

7.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RT-PCR试剂盒含有10mMdNTPs 0.15ul，50U/ul逆转录酶1ul，10倍浓度PH7.5的逆转录缓冲液1.5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0.19ul，购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-21和/或miR-181b特异性逆转录引物3ul和无核酸酶水4.16ul。

8.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于实时定量PCR反应试剂盒含有TaqMan通用PCR总混合物、无核酸酶水和miR-21和/或miR-181b特异性PCR引物，TaqMan通用PCR总混合物中含有DNA聚合酶、UNG酶、含dUTP的dNTPs、内参、缓冲液。

9.权利要求2的判断胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于实时定量PCR反应试剂盒含有TaqMan 2倍浓度通用PCR总混合物10ul、无核酸酶水7.67ul和购自Applied Biosystem的20倍浓度miR-21和/或miR-181b特异性PCR引物1ul。

10.权利要求2的试剂盒的使用方法：

a、使用RNA提取试剂盒

1)、用移液器将样本反复吹打混匀，各吸取样本350ul到两个1.5ml离心管中，向其中一管加入1ng的RNA作为阳性对照；

2)、加入1.05ml Trizol，振荡5min，混匀，分为两管；

3)、各加入600ul氯仿再振荡5min；

4)、室温静置5min，13200rpm离心10min，取800ul上层有机相到新的离心管；

5)、加入500ul异丙醇和1ul显色剂，上下颠倒管子，-20℃冰浴2h；

6)、2h后，取出冰浴样本，4℃，13200rpm离心10min，弃上清，可见离心管底有蓝色沉淀；

7)、加1ml 75％乙醇，上下颠倒离心管，13200rpm离心5min弃上清；

8)、再离心1min，用枪头吸去上清；

9)、放通风柜，晾干；

10)、10ul无核酸酶水溶解，-80℃保存；

b、使用RT-PCR试剂盒：

1)、将10mM dNTPs0.15ul，逆转录酶1ul，10倍浓度PH7.5的逆转录缓冲液1.5ul，20U/ulRNA酶抑制剂0.19ul，购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-21和/或miR-181b特异性逆转录引物3ul、无核酸酶水4.16ul、5ul RNA试剂盒提取的样品混匀瞬离，分装，加入对应的模板混匀，再加入无核酸酶水至总体系为15ul；

2)、将步骤1的材料在普通PCR仪上进行逆转录，16℃保持30min，42℃保持30min，85℃保持5min，4℃保持过夜；

3)、取步骤2中的材料20ul，继续在普通PCR仪上反应，a)95℃保持10min，b)55℃保持2min，c)72℃保持2min，d)95℃保持15秒，e)60℃保持4min，f)重复步骤d)、e)12次，g)99.0℃保持10min；

C、使用实时定量PCR试剂盒：

1)将10ul TaqMan2倍浓度通用PCR总混合物、7.67ul无核酸酶水、1ul购自 AppliedBiosystem的20倍浓度miR-21和/或miR-181b特异性PCR引物、RT-PCR试剂盒获得的miRNA逆转录产物稀释5倍后的产物1.33ul混匀；

2)在普通PCR仪上反应，a)95℃保持10min，b)95℃保持15秒，c)60℃保持60秒，d)重复步骤b)、c)45次，g)4℃保存待检测。