[发明专利]同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法

权利要求书

1.一种同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其步骤为：

(1)引物设计合成：

(a)设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG2R：5’-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’，R＝A或G，Y＝C或T；

(b)分别设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F，引物序列如下：

SPFF：5’-GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’，

SPCF：5’-GTGAGAAAYCTATGCGCTCTGTT-3’，

SPGF：5’-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG-3’，

SP2F：5’-CGTACATTGAAAAGAGAAACAGGATA-3’，

其中，Y＝C或T；

(c)每对引物扩增片段大小及待测病毒为：

(2)CTAB法提取感病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；

(3)一步法RT-PCR扩增；

(4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

2.根据权利要求1所述的同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于，所述CTAB法提取感病植物组织的总核酸为：将3～5片病叶叠加在一起，称取100mg左右至研钵中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mMTris-HCl，pH 8.0，1.4MNaCl，20mMEDTA，0.2％巯基乙醇)；充分研磨后，转入1.5mL离心管中，65℃温浴15～60min；13000r/min离心15min，取750μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋震荡混匀30s；13000r/min离心10min，小心转移600μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，13000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 70％乙醇，13000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀10～15min；加入100μL 20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)并置于冰上10min，用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解，-20℃保存备用，也可以将所获得的总核酸以干粉状态放入-86℃进行长期保存。

3.根据权利要求1所述的同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于，所述一步法RT-PCR的反应体系为20μL，包括10μL 2×Reaction mix(含0.4mM各dNTP，2.4mM MgSO₄的buffer)、2μL 10μM引物SPFF、0.4μL 10μM引物SPCF、2.5μL 10μM引物SPGF、0.2μL 10μM引物SP2F、2μL 10μM引物SPFCG2R、0.7μL ddH₂O、1μL RNA模板和1.2μL Enzyme mix(含SuperScript^TM III RT及Taq High Fidelity)。

4.根据权利要求1所述的同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于，所述一步法RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min，94℃2min，94℃ 30s、60℃ 30s、65～68℃ 1～3min，扩增30个循环，72℃延伸5min后4℃保存。