[发明专利]同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，属植物保护领域。

背景技术：

甘薯是世界第七大粮食作物，也是发展中国家继水稻、小麦、玉米和木薯后的第五大粮食作物，年产量达1亿2700万吨，中国是世界最大甘薯生产国，年产量占世界的82.7％。甘薯主要靠秧蔓、薯块进行无性繁殖，极易造成病毒的传播和积累。病毒病是继甘薯小象甲后对甘薯生产为害最大的限制性因素之一，每年因病毒侵染造成的甘薯减产高达30％-50％，中国每年因甘薯病毒病造成的损失高达40亿元。据报道侵染甘薯的病毒有20多种，其中甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)、甘薯C病毒(Sweet potato virus C，SPVC)、甘薯G病毒(Sweetpotato virus G，SPVG)和甘薯病毒2(Sweetpotato virus 2，SPV2)等四种病毒为甘薯上经常发生的马铃薯Y病毒属成员。SPFMV几乎在世界甘薯产区都有发现，常造成甘薯产生褪绿斑或沿叶脉形成紫色羽状斑纹，SPFMV的RC株系可在某些甘薯品种表面或内部形成褐色龟裂或木栓化，而O株系的症状较轻。SPVC过去被认为是SPFMV的C株系，最近的研究表明该株系应该是一个独立的种，其单独侵染甘薯不产生明显症状。SPVG最早于中国被发现，目前几乎在中国甘薯产区都有为害，而SPV2(有的称为SPVY或IVMV)自台湾首次发现后，也逐渐在很多国家被报道，SPVG和SPV2单独侵染甘薯也往往不产生明显症状。然而，这些病毒在田间往往复合侵染，常造成甘薯产量降低、品质变劣和种性退化，进一步加重了对甘薯的危害。迄今，国内外尚无特别有效的植物病毒病防治药剂，因此加强甘薯病毒检测尤其是对四种主要病毒的检测和监测，对于准确诊断病害和防止病毒的传播流行具有重要的现实意义，是生产上对甘薯病毒病进行综合治理的重要措施之一。

通常检测甘薯病毒的方法有鉴别寄主法、电镜技术、血清学技术和分子生物学技术等。鉴别寄主法中往往将病组织摩擦接种或嫁接至指示植物巴西牵牛(Ipomoeasetosa)上，而且常常要复合接种甘薯褪绿矮缩病毒(SPCSV)，通过SPCSV的协生作用来观察待测病毒的症状反应，检测周期长、灵敏度低，还受到季节、环境以及病毒种类等方面的影响，因此已经很少用于甘薯病毒的检测。由于电镜技术仅能观察到病毒的粒体形态，很难准确鉴定出病毒种类，而且设备昂贵，不适合作为甘薯病毒检测的普通方法。目前应用最为广泛的甘薯病毒检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和分子生物学技术。ELISA方法检测周期较短，灵敏度高，一次可以对大规模样品进行检测，然而由于SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2在系统进化上关系非常近，具有部分血清学交叉反应，往往造成对一些病毒的漏检或误检。分子生物学技术，尤其是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性、灵敏度较ELISA方法高，但普通RT-PCR方法每次只能检测一种病毒，对于多种病毒复合侵染的情况，则需要针对每种病毒进行单独检测，工作量大，效率不高。此外，通常的RT-PCR检测前都需要使用价格昂贵的RNA提取试剂提取病组织总RNA，导致检测成本偏高。现有的很多植物病毒多重RT-PCR检测技术中，每一种病毒均需要一对检测引物，增加了引物间相互作用的概率，往往容易导致假阴性和非特异性，影响了检测结果的准确性。

申请号为200810049503.2的专利公开了一种能同时检测甘薯潜隐病毒(SPLV)、SPVG和SPFMV三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，由于SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2在系统进化上关系非常近，该方法设计的引物无法区分SPFMV和SPVC，而且其中的引物SEQ6既能与SPVG的基因组RNA结合也能与SPV2的基因组RNA结合。

发明内容：

本发明克服了现有技术在检测多种病毒复合侵染甘薯时的不足，提供了一种高效、灵敏、特异且低成本的检测甘薯上发生的SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2四种病毒的方法。

本发明的技术方案为：

(1)引物设计合成：

(a)设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG2R：5’-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’，R＝A或G，Y＝C或T；

(b)分别设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F，引物序列如下：