[发明专利]一种检测莱克多巴胺的免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及莱克多巴胺残留物的检测试剂，具体涉及一种检测莱克多巴胺的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)属于β-兴奋剂，近年来被非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长，因其添加剂量是治疗剂量的5-10倍，以至于在动物体内残留量高而给消费者带来危害。目前现场筛查用检测试剂多用莱克多巴胺胶体金试纸进行检测，但因其灵敏度低不能很好满足要求，因此需要开发可在现场更为准确和快速的检测方法。

基于抗原-抗体免疫学反应的侧流免疫层析检测技术(LFIAs)是20世纪90年代初发展起来的新兴技术，因其快捷方便的特性，非常适宜用于现场的快速监测。但目前该类技术多采用胶体金作为信号标记分子，受其灵敏度等的限制，只能用于定性检测。

超顺磁性复合粒子具有良好的磁学特性，由于其受背景干扰小，特别适宜于不含磁性物质的生物样品的检测。胶体金和荧光标记分子用于测流免疫层析检测时，只可在其检测区膜表面观测到约10％的信号分子强度，而用超顺磁性复合粒子作为标记材料，则可检测到检测区膜三维立体结构中的所有磁信号分子，可极大提高灵敏度，并可用对应的磁信号检测仪达到定量测定，因此，超顺磁性复合粒子是近年来在LFIAs中受到关注的材料。

然而，目前报道的生物检测用磁性纳米复合粒子多采用化学法如共沉淀法先制备得到有机相的磁性纳米粒子后，再采用硅(SiO₂)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明胶等高分子材料对其表面进行稳定化包覆修饰，以得到稳定的、水溶性的磁性标记材料。但这些制备修饰方法往往较为繁琐复杂，得到的超顺磁性复合粒子在尺寸大小、生物相容性、饱和磁强度、外磁场响应速度、稳定性和标记效率等方面不能同时满足LFIAs的要求：其尺寸多在200～300nm之间，由于磁珠颗粒偏大，在试纸上的泳动时间较慢，显色时间较长；而太小的粒子又无法提供足够的磁共振信号；另外还有生物相容性不稳定、磁珠容易聚合等问题；这些不足限制了超顺磁性复合粒子在LFIAs中的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测莱克多巴胺的免疫层析试纸。

本发明提供的检测莱克多巴胺的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记莱克多巴胺抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有莱克多巴胺抗原，所述质控线含有能与所述莱克多巴胺抗体特异结合的抗抗体。

所述反应垫为硝酸纤维素膜；

所述超顺磁性复合粒子标记莱克多巴胺抗体为将莱克多巴胺抗体和超顺磁性复合粒子的以肽键共价结合形成的聚合体；

所述莱克多巴胺抗体为莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺多克隆抗体，所述莱克多巴胺抗体具体为莱克多巴胺单克隆抗体(广州市江森生物科技有限公司，JS-23-0004)；

所述莱克多巴胺抗原为莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物；小分子抗原物质与载体蛋白偶联时，每个载体蛋白分子上所连接的半抗原的平均数目称为偶联比或结合比。为达到载体蛋白与NC膜的良好结合，同时又能最大程度地保证莱克多巴胺半抗原空间位点的延展，选择合适的偶联比是非常重要的。偶联比的大小与半抗原功能基团的活性、位阻、反应投料比及反应条件有关。一般通过调节半抗原与载体的摩尔比、反应环境pH值、温度、离子强度等来控制偶联比。

所述载体蛋白与所述莱克多巴胺半抗原的偶联比为1∶8～1∶10，适于抗原的包被和莱克多巴胺半抗原空间位点的延展，所述载体蛋白与所述莱克多巴胺半抗原的偶联比具体为1∶10；

所述与所述莱克多巴胺抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；

所述莱克多巴胺抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为1mg/ml。

所述超顺磁性复合粒子标记莱克多巴胺抗体按照如下方法制备：

1)将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1.15mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1ml浓度为0.1M、pH值为4.7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(称取1.066g MES、0.45g NaCl溶于50ml纯水，调pH至4.7)混匀，反应，得到活化后磁性粒子；

2)将每2.5mg步骤1)得到活化后磁性粒子、0.15mg莱克多巴胺抗体和0.8ml浓度为50mM pH为8.5的硼砂缓冲液混匀、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；