[发明专利]含有etr1基因的双元表达载体的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种含有etr1基因的双元表达载体的构建方法及其应用。

背景技术

乙烯是高等植物中促进器官衰老和果实成熟的激素。ACC合成酶、ACC 氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键酶，ETR是信号传导途径的关键酶。根据同源依赖性基因沉默(HDGS) 原理，导入正义基因和反义基因均可实现内源基因沉默。使用反义RNA技术，有效抑制乙烯生物合成和阻断其信号传导, 从而延长切花植物的瓶插寿命。目前国外已从番茄、苹果、豌豆、桃、矮牵牛、香石竹、猕猴桃等植物中克隆到ACC氧化酶基因；澳大利亚的研究者将香石竹ACC氧化酶基因cDNA导入香石竹后，使香石竹花瓣衰老明显延迟；Satoh等在菊花中转入mDG-ERS1(etr1–4)基因（这是从菊花中克隆的编码乙烯受体蛋白的突变体）也成功获得了叶片黄化现象明显减少的植株。

在国内，也有不少关于观赏植物中乙烯与花朵开放、衰老关系的报道，而鲜切花可方便的装饰各种环境，但鲜切花的瓶插寿命极短，一般只有几天，如果要保持较好的观赏效果，就要频繁的更换，这造成了极大的浪费。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种含有etr1基因的双元表达载体的构建方法及其在延长鲜切花瓶插寿命中的应用，将含有etr1基因的双元表达载体导入鲜切花，转基因的切花获得对乙烯不敏感的性状，可有效控制切花的衰老，延长其瓶插寿命。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

    含有etr1基因的双元表达载体的构建方法：扩增拟南芥突变体etr1基因并克隆至表达载体pEASY-T1上获得pEASY-T1-etr1质粒，在该质粒的AscI和BamHI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etr1基因片段，用同样的双酶切体系对pFGC5941质粒进行双酶切获得骨架片段，将etr1基因片段和骨架片段用T4 DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941-etr1双元表达载体。

上述构建方法中，扩增拟南芥突变体etr1基因的正向引物为5’- ttGGCGCGCCaaCTCCCCTTTTCTCCTTCTC-3’，其中GGCGCGCC是添加的酶切位点，tt、aa是添加的保护碱基，CTCCCCTTTTCTCCTTCTC是特异引物序列；扩增拟南芥etr1基因的反向引物为5’- cgGGATCCcgCCTTTACATGCCCTCGTACA-3’，其中GGATCC是添加的酶切位点，cg、cg是添加的保护碱基，CCTTTACATGCCCTCGTACA是特异引物序列。

前述含有etr1基因的双元表达载体的构建方法所述的拟南芥突变体etr1基因来自于编号为CS237的拟南芥突变体。

本发明还提供了前述含有etr1基因的pFGC5941-etr1双元表达载体在延长鲜切花瓶插寿命中的应用。

采用前述双元表达载体延长鲜切花瓶插寿命的方法：用含有etr1基因的pFGC5941-etr1双元表达载体转化根癌农杆菌LAB4404感受态细胞，采用根癌农杆菌介导的植物转基因方法将Atetr1基因导入鲜切花植物基因组，转化成功后常规培养，即可。

与现有技术相比，本发明成功的使用拟南芥CS237突变体，克隆显性突变基因etr1构建了双元表达载体，将该载体导入鲜切花后，能有效抑制乙烯信号传导途径中的下游基因表达，使转基因的鲜切花获得对乙烯不敏感的形状，可将鲜切花寿命延长5～10天。

附图说明

图1是质粒pEASY-T1-ertr1结构简图；

图2是质粒pFGC5941结构简图；

图3是质粒pFGC5941-etr1结构简图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式详细说明本发明的技术方案。

1、克隆etr1基因

拟南芥etr1突变体编号为CS237，购自拟南芥生物资源中心（The Arabidopsis Biological Resource Center ，ABRC），播种于营养钵中，置于温控培养箱中生长，当植物生长到7～11片真叶时，用于RNA的提取。

1.1总RNA提取

按TaKaRa的RNAiso Plus试剂盒说明进行以下操作：

 称取100克新鲜植物材料，加入适量的RNAiso Plus试剂，室温静置5分钟；

 12000g、4℃离心5分钟，上清液转移至1.5ml离心管中；