[发明专利]类人弹性蛋白及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种类人弹性蛋白及使用基因工程技术生产类人弹性蛋白的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

人弹性蛋白是一种水溶性较低、无定形、疏水性强且广泛交联的细胞外基质蛋白，其在皮肤、肺脏、韧带和血管等组织中含量较高，并在维持组织弹性中发挥着重要作用。人弹性蛋白基因是定位于第7号染色体的单拷贝基因，其外显子交替编码疏水重复序列和含有赖氨酸的蛋白序列。人弹性蛋白原全长有760个氨基酸残基，分子量约为70kDa。弹性蛋白原的翻译后修饰包括信号肽切除和部分脯氨酸残基的羟化。尽管弹性蛋白疏水性极强，然而其可被高度水化，而且仅在水分子存在的条件下，弹性蛋白才具有弹性。

在大多数组织，弹性蛋白的合成开始于妊娠中期，在出生时和新生儿期达到峰值，此后其表达水平迅速降低，成年后几乎完全消失。弹性蛋白的表达调控主要集中在转录水平和转录后水平。例如，TNF-α和bFGF下调弹性蛋白基因表达，而糖皮质激素、IL-1、IL-10和IGF-1等则促进其表达。TGF-β1则通过提高弹性蛋白mRNA稳定性来促进弹性蛋白的沉积。弹性蛋白基因转录产物存在多种剪接变异体，从而翻译产生多种弹性蛋白原。然而每一种剪接变异体均由编码高度疏水和高度亲水多肽的外显子交替排列。弹性蛋白的疏水区含有大量的脂肪族氨基酸重复序列，该独特序列的基本结构为GX、PX、GGX和PGX，其中X为G、A、V、L和I中的任意一种。富含赖氨酸的区域是弹性蛋白中主要的交联功能域。

在正常生理条件下，弹性蛋白几乎不被降解。然而，在某些病理条件下，弹性蛋白可被降解产生大量的弹性蛋白肽，该降解过程主要由MMP-2、MMP-9、MMP-7和MMP-12完成。此外，在炎症条件下，白细胞释放的弹性蛋白酶可使弹性蛋白网络完全崩解。弹性蛋白肽并非简单的弹性蛋白降解产物，其能通过受体依赖方式作用于组织细胞，包括成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等，产生重要的生物学效应。

Senior等发现弹性蛋白原和弹性蛋白降解片段可对人白细胞和成纤维细胞产生特异性趋化效应，由此提出细胞表面存在弹性蛋白肽膜受体。此后，Wrenn等发现¹²⁵I标记的弹性蛋白原能够以受体介导方式与动脉韧带成纤维细胞结合。现已表明，弹性蛋白受体存在于多种细胞表面，其由3个亚基组成，其中分子量为67kDa的亚基（elastin binding protein，EBP）介导与弹性蛋白结合。EBP不仅与VGVAPG序列高亲和性结合，而且其具有半乳糖凝集素特性，可与半乳糖和乳糖结合，此后证实EBP是β半乳糖苷酶的一种剪接变异体。除了VGVAPG等弹性蛋白肽以外，EBP尚可通过识别B1层粘连蛋白中的LGTIPG序列而与之结合。

弹性蛋白及弹性蛋白肽的主要生物学效应是趋化细胞和促进细胞增殖。首先，弹性蛋白和弹性蛋白肽可以通过增加细胞内cAMP、cGMP和钙离子水平趋化单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞。其次，弹性蛋白和弹性蛋白肽可以促进成纤维细胞和平滑肌细胞增殖，其机制涉及开放L型钙离子通道、激活百日咳毒素敏感的G蛋白，同时c-Src、Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路和PDGF受体也参与细胞增殖过程。由此可见，弹性蛋白肽在创面愈合过程中也发挥着重要作用。

近年来，随着对弹性蛋白研究逐渐深入，使用弹性蛋白中具有生物学活性的部分功能模块制备组织工程支架和靶向给药系统的报道日益增多。这些研究多使用由VPGXG串联重复序列（其中X为V、A或G等非P氨基酸）构成的重组蛋白分子，即弹性蛋白样蛋白（elastin-like protein，ELP），结果表明ELP具有非常好的生物相容性、极低的免疫原性、良好的药代动力学。此外，ELP可以作为融合标签，使得原核表达的重组蛋白纯化过程变得非常简单。

1)  生物相容性：ELP没有细胞毒性和急性系统毒性，没有皮肤刺激性和系统免疫原性。此外，ELP不会改变出凝血时间也不会诱导红细胞裂解。ELP具有生物降解特性，由其制备的支架材料移植至体内2周后即被全部降解。