[发明专利]一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，涉及一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，是对不同种罗非鱼的鉴别。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，是世界性养殖品种，该鱼上世纪50年代引入我国，得到了较快发展，现中国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。目前，我国主要养殖的罗非鱼品种有尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)，奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和奥尼杂交罗非鱼，其中奥尼罗非鱼是尼罗罗非鱼(♀)和奥利亚罗非鱼(♂)的杂交1代，具有雄性率高、生长快、抗病力强等优点，但它的雄性率和养殖性能与亲本的种质纯度密切相关。由于罗非鱼品种间很容易杂交，且杂种可育，杂交种形态又与亲本很相似，传统的形态辨别方法又很难准确辨别纯种和杂交种。因此，很容易造成罗非鱼种质混杂，导致优良经济性状退化，这也是目前制约我国罗非鱼良种保护和养殖发展的突出问题。

尼罗罗非鱼，奥利亚罗非鱼及其它们杂交鱼鉴别方面，学者们曾利用同工酶技术、RAPD技术、微卫星标记技术等建立了区别它们的生化和分子遗传标记。然而，同工酶是基因表达产物，但检测位点有限，对亲缘关系较近或遗传基础复杂的品种不容易区分；RAPD方法虽然是从基因水平鉴别不同品种，但RAPD方法对反应条件的变化很敏感，许多反应因素稍微有差异就会导致扩增带型发生改变，稳定性和重复性较差，从而限制了其应用。微卫星标记又称简单序列重复标记(SSR)与同工酶、RAPD、RFLP 等技术相比，具有多态性频率高、检测容易、重复性好、共显性的孟德尔式遗传等优点，被广泛用于品种及亲子鉴定等研究，但应用微卫星标记进行多重PCR来快速、准确地鉴别不同罗非鱼品种的研究还未见报道。采用特异微卫星标记技术进行多重PCR分析尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼以及它们的杂交鱼的遗传特性，可以建立快速、准确鉴别不同罗非鱼品种的方法。

发明内容

发明目的

本发明的目的是提供一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，有助于快速、准确鉴别不同种罗非鱼，在罗非鱼保种、选育和养殖生产中有极大的应用价值。

技术方案

一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法，其特征在于，采用以下提取步骤：

（1）选用3对特异微卫星引物组合进行多重PCR反应，其中这3对特异微卫星引物如下：

CCCTCTGTTTCCATCTCA；GATACCTGTCCATACCTCCTC；

GCTCGCTCCAGAAAAATCAC；GTCAAAAAGGCATGGCAAAG；

CTGCACTTTTACTGAGGG；TGGGAGATTAACAGAATAACA

（2）从待测罗非鱼采样血液或鳍条，采用DNA提取法提取基因组DNA；

（3）用步骤（2）的基因组DNA为模板，步骤（1）所选的3对微卫星引物组合进行多重PCR扩增；

（4）对步骤（3）的PCR产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。

（5）根据多重PCR的电泳检测结果，鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及它们的杂交鱼。

步骤（3）中，在进行PCR扩增时，PCR反应总体积为15 μL，其中含10×反应缓冲液1.5 μL，Mg²⁺　2 mmol/L，dNTP　200μmol/L, 3对上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.4U，DNA 50 ng～100 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积。

步骤（3）中，PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，52 ℃退火 20s，72 ℃ 20s，25～30个循环；72℃延伸5 min。

本发明具体如下步骤实现：

（1）选用3对特异微卫星标记引物组合进行多重PCR反应。

（2）从待测罗非鱼采样血液或鳍条，采用DNA提取法提取基因组DNA。

（3）用步骤（2）的基因组DNA为模板，步骤（1）所选的3对微卫星引物组合进行多重PCR扩增。

（4）对步骤（3）的PCR产物用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。