[发明专利]一株生产莽草酸的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种莽草酸生产菌株及其构建方法。 

背景技术

莽草酸(shikimic acid)是生物合成芳香族氨基酸的通路即莽草酸途径的重要中间体，已报道的生理功能有：通过影响花生四烯酸代谢来抑制血小板聚集，从而可以抑制动、静脉血栓及脑血栓形成；具有抗炎、镇痛作用；还可作为抗病毒和抗癌药物的中间体，有广泛的药用价值等等。其化学名称为3，4，5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，化学结构式如下： 

目前用以治疗H5N1型禽流感病毒的特效药物为磷酸奥司他韦(oseltamivir phosphate)，商品名为达菲，而莽草酸正是抗禽流感药物“达菲”合成的关键手性起始原料。目前生产所需莽草酸大部分来自于中国广西的木兰科植物---八角，但是此种生产工艺复杂，得率较低，且原料易受季节、气候等因素限制，难以满足大规模生产所需，瑞士罗氏公司拥有此种达菲生产的专利权，价格昂贵。 

因此，对微生物芳香族氨基酸代谢流改造以提高莽草酸产量具有广阔前景。微生物生长所需的原材料如葡萄糖等随时可获得，其繁殖速度快，代谢能力强，故而周期短，且生产过程对环境污染小，成本低廉，相比于植物提取具有很大的优势。故而通过生物手段改造工程菌从而使之大量生产莽草酸具有很重要的经济、社会效益。 

发明内容

本发明的目的在于通过基因工程的方法对大肠杆菌CCM(central carbon metabolism)及莽草酸途径进行改造，从而提供一种新的莽草酸的生产菌株。 

本发明的另一个目的在于提供所述的莽草酸生产菌株的构建方法。 

本发明的莽草酸生产菌株的构建方法包括以下步骤： 

(1)、构建敲除ptsHIcrr操纵子、ydiB、shiA、aroL和aroK基因以及整合T7RNA聚合酶的大肠杆菌DHPYASA-T7。 

(2)、构建含有T7启动子的莽草酸代谢途径中的关键基因tktA、glk、aroE、aroF以及aroB的重组表达质粒pAOC-TGEFB。 

(3)、将重组表达质粒pAOC-TGEFB转化改造菌株DHPYASA-T7获得莽草酸的生产菌株DHPYAS-T7。 

本发明所述菌株与国内外现有专利相比，创新之处在于以下两点： 

(1)、敲除ptsHIcrr操纵子基因，提高莽草酸途径前体PEP的供给。ptsHIcrr基因敲除或突变解除了“分解物代谢阻遏现象”，能更有效地利用复合培养基水解产物来维持菌体生长，PTS系统缺失菌株依赖GalP及Glk以ATP提供的磷酸基进行葡萄糖磷酸化转运，该葡萄糖转运系统提高胞内PEP的利用率，有利于增加碳流进入芳香族氨基酸途径； 

(2)、敲除ydiB基因提高莽草酸产量。YdiB是一种双功能酶(奎尼酸/莽草酸脱氢酶)，与奎尼酸(QA)代谢紧密相关，ydiB基因敲除后菌株缺乏奎尼酸脱氢酶活性，三脱氢奎尼酸(DHQ)合成QA途径受阻，副产物QA产量下降，DHQ得到积累并在脱氢奎尼酸脱水酶催化下合成大量三脱氢莽草酸(DHS)；而莽草酸脱氢酶活性可以通过aroE基因的过表达得到补偿，高浓度的DHS作为莽草酸脱氢酶的底物，高效合成莽草酸，目的产物产量显著提高； 

本发明所构建的莽草酸生产菌株DHPYAS-T7已于2011年03月03日提交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4631。 

利用本发明所获得的基因工程菌株DHPYAS-T7进行发酵，可以有效获得目的产物莽草酸的积累，从而为莽草酸生物合成的产业化奠定了基础。 

附图说明

图1为ptsHIcrr基因敲除策略，其中L为大肠杆菌中ptsHIcrr上游同源基因，R为ptsHIcrr下游同源基因。 

图2为DH5αΔptsHIcrr敲除菌DHP的PCR鉴定，显示ptsHIcrr基因已被成功敲除；其中M为DNA marker；1，2为野生型大肠杆菌DH5α；3为ptsHIcrr敲除菌。 

图3为pET-28a-YLR/DH5α阳性菌鉴定结果；其中M为DNA Marker，11-20为经pET-28a-YLR转化后的大肠杆菌不同单菌落进行PCR鉴定的结果，结果显示11-14、16、19均为阳性条带。