[发明专利]一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法

权利要求书

1.一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)、重组人干扰素-α2b表达载体的构建：

设计上下游引物P1和P2，其中

P1：GGCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCAC

P2：GGGGATCCTTATTCCTTACTTCTTAAACTTTC

以人干扰素-α2b基因为模板，并用P1和P2引物通过PCR扩增法获得人干扰素-α2b基因片段，将PCR产物经过Nde I和BamH I双酶切插入原核表达载体pJW-2的Nde I和BamH I的酶切位点，所述原核表达载体pJW-2含有P_RP_L串联启动子，再转化至E.coli BL21感受态细胞，以获得含有重组表达载体pJW-2-rhIFN-α2b的E.coli BL21细胞；

(2)、pACYCDuct-1-MetAP表达载体的构建：

设计上下游引物P3和P4，其中

P3：GCCCATGGGCTATCTCAATCAAGACC

P4：CGGGATCCTTATTCGTCGTGCGAGATTAT

以甲硫氨酸氨基肽酶(MetAP)基因蛋白质编码区为模板，并用P3和P4引物通过PCR扩增法得到MetAP基因片段，将PCR产物MetAP经过Nco I和BamH I双酶切插入原核表达载体pACYCDuct-1的Nco I和BamH I的酶切位点，获得重组质粒pACYCDuct-1-MetAP；

(3)、将(2)步骤中获得的重组质粒pACYCDuct-1-MetAP转化至含有重组表达载体pJW2-rhIFN-α2b的E.coli BL21感受态细胞，筛选出高效表达的阳性克隆菌，获得含有双质粒的重组表达菌株MetAP-pJW2-rhIFN-α2b，诱导表达并提取、复性和纯化，最终得到去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b。

2.根据权利要求1所述的去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，将测序验证正确的双质粒重组表达菌株MetAP-pJW2-rhIFN-α2b转化至E.coli BL21感受态细胞，挑取单克隆于含5ml LB液体培养基的试管中，37℃，225rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.4～1.0，加0.1μM IPTG，42℃剧烈摇晃培养3小时；收集各试管的菌体做SDS-PAGE电泳，使用Western blotting选出阳性克隆菌；取1ml阳性克隆菌液接种于2000ml的LB液体培养基扩大培养，37℃，225rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.4～1.0，加0.1μM IPTG，42℃剧烈摇晃培养3小时，于4℃，6000rpm，离心10min，去掉上清并收集菌体。

3.根据权利要求2所述的去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的试管振荡均培养至OD₆₀₀为0.6。

4.根据权利要求2所述的去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法，其特征在于：将步骤(2)中收集的菌体加入裂解液，加入方式为1g菌体中加入裂解液5mL，并按0.1mg/1g菌体的比例分别添加溶菌酶和DNA酶，搅拌后，37℃水浴锅3h，-20℃冰柜冻融，加入洗涤液搅匀，洗涤液的加入方式为1g菌体中加入洗涤液20mL，离心，弃上清液，取沉淀重复洗涤三次后获得包涵体；

在包涵体中加入变性液，变性液的加入方式为1g包涵体中加入变性液50mL，搅拌3h，15000rpm，20min，取上清液。向上清液中加入复性液，复性液的加入方式为1mL上清液中加入复性液100mL，4℃搅拌24h，超滤，过层析柱，纯化回收去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b。

5.根据权利要求4所述的去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法，其特征在于：所述的裂解液的组成为Tris 0.1M，Nacl 0.1M，EDTA0.5M，β-巯基乙醇2mM，PH 9.0。