[发明专利]一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于干扰素的制备领域，具体涉及一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法。

背景技术

干扰素(IFN)是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统(人体免疫系统的一种)、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白，它不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(如NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用。

在蛋白质翻译过程中，起始密码子ATG都会翻译成甲硫氨酸(Met)并保留在翻译初始物的N端，一般需将其切除才能转变为成熟蛋白。N端起始Met的切除通常对蛋白质的功能和稳定性十分重要。干扰素作为蛋白质，其翻译修饰过程亦是如此，但N端起始Met并不是其成熟结构所必须的残基，N端起始Met的存在影响干扰素的活性，增加了不良反应的发生率。

人们尝试了很多种方法去除蛋白质N端Met：其一、溴化氰曾被用于在强酸环境下裂开Met，但此法的限制是蛋白质内部不能有其他Met残基；其二、在目标蛋白前引入蛋白酶特异性的短肽，之后短肽会在体外被各自的蛋白酶切除，例如Xa因子、肠激酶、载脂蛋白酶C；其三、用溶解蛋白单孢菌的氨肽酶在体外切除；其四，在目标蛋白前引入信号肽，进行分泌型表达，但这种方法产率很低。

发明内容

本发明的目的是提供一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法，本方法能够去除重组人干扰素-α2b的N端的非必要Met残基，提高人干扰素-α2b的稳定性和抗病毒活性，降低其免疫原性，减少患者使用人干扰素-α2b时的不良反应发生率。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、重组人干扰素-α2b表达载体的构建：

设计上下游引物P1和P2，其中

P1：GGCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCAC

P2：GGGGATCCTTATTCCTTACTTCTTAAACTTTC

以人干扰素-α2b基因为模板，并用P1和P2引物通过PCR扩增法获得人干扰素-α2b基因片段，将PCR产物经过Nde I和BamH I双酶切插入原核表达载体pJW-2的Nde I和BamH I的酶切位点，所述原核表达载体pJW-2含有P_RP_L串联启动子，再转化至E.coli BL21感受态细胞，以获得含有重组表达载体pJW-2-rhIFN-α2b的E.coli BL21细胞；

(2)、pACYCDuct-1-MetAP表达载体的构建：

设计上下游引物P3和P4，其中

P3：GCCCATGGGCTATCTCAATCAAGACC

P4：CGGGATCCTTATTCGTCGTGCGAGATTAT

以甲硫氨酸氨基肽酶(MetAP)基因蛋白质编码区为模板，并用P3和P4引物通过PCR扩增法得到MetAP基因片段，将PCR产物MetAP经过Nco I和BamH I双酶切插入原核表达载体pACYCDuct-1的Nco I和BamH I的酶切位点，获得重组质粒pACYCDuct-1-MetAP；

(3)、将(2)步骤中获得的重组质粒pACYCDuct-1-MetAP转化至含有重组表达载体pJW2-rhIFN-α2b的E.coli BL21感受态细胞，筛选出高效表达的阳性克隆菌，获得含有双质粒的重组表达菌株MetAP-pJW2-rhIFN-α2b，诱导表达并提取、复性和纯化，最终得到去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b。

本发明还可以通过以下技术措施得以进一步实现：