[发明专利]一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从药用植物中提取分离萘醌类成分的技术领域，更具体涉及一种从紫草抗肿瘤活性成分-萘醌类的提取方法，这些活性成分不仅有抗肿瘤的作用，还有抗炎、解热、镇痛、镇静、抗病原微生物、抗生育作用、保肝等作用，能广泛用于医药卫生行业。

背景技术

紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebaieuchroma(Royle)Johnst的干燥根，紫草中主要药效成分为萘醌类色素，包括紫草素、去氧紫草素、β，β二甲基丙烯酰紫草素、乙酰紫草素等。从紫草中分离出萘醌类有效成分，其药理作用不仅有抗病原微生物作用；抗病毒作用；抗炎作用；消化道平滑肌的作用。主要有抗癌作用，由新疆紫草中提得的紫草素(Shikonin)，510mg/kg可完全抑制腹水型肉瘤₁₈₀细胞的生长。10mg/kg可延长带瘤小鼠生命92.5%。紫草素(Shikonin)对小鼠肝癌H₂₂和Lewis肺癌的放射增敏作用。

目前，对紫草萘醌成分的提取纯化方法有较多的研究报道，但大多是传统的提取分离工艺，分离时间长，提取杂质多；溶剂耗损大；不易分离得到高纯度的药用成分。本专利提供的提取分离方法，是利用Dr FlashⅡ型中低压制备色谱快捷、高效、量大的一种优良提取分离工艺, 也能获得纯度较高的有效成分。

发明内容

    本发明的目的是在于提供了一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，方法易行，操作简便，该方法是利用中低压制备色谱；高效分离抗癌活性成分的优化工艺，且含量在95%以上.。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，其步骤是：

1、  将紫草干燥茎块烘干、粉碎后用乙醇超声提取，乙醇的倒入量为药材重量的5~10倍。置入超声仪中超声30~50min，再将超声后的物质过滤，回收过滤溶液中的溶剂。将回收的溶剂再倒入三角瓶，继续超声，重复本步骤3~5次，得到用乙醇提取的干浸膏。

2、  分别用溶剂石油醚和乙酸乙酯将乙醇干浸膏萃取，石油醚和乙酸乙酯的量为浸膏的4～7倍，反复萃取3～5次，至萃取液无色，分别将石油醚和乙酸乙酯萃取液过滤；回收过滤溶液中的溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏。

3、将以上二种浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，用其1～3倍量的400-500目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯气味；取400ml、1500mL Flash柱（也可以用玻璃和不锈钢柱）各一个，400ml的柱装拌样硅胶，1500ml的柱仅装硅胶作为分离柱。二根柱都干法上样；分别用石油醚洗脱至柱平衡，再将二根柱串联，串联后的柱子接到中低压（0.1~5兆帕）制备型色谱柱上。中低压（0.1~5兆帕）制备色谱柱的制备条件为泵压力100-200帕，流速100ml/min，检测器的监控波长为395nm，检测器的收集波长为280nm，死体积为7mL。

4、洗脱剂为石油醚含B（B是按乙酸乙酯：丙酮=4:1混合的溶剂）2%（v/v），6%（v/v），10%（v/v）的比例洗脱，每组洗脱剂中还加上0.2%（v/v）的甲酸，即，洗脱剂为1份B加49份石油醚加0.1份甲酸混合，在中低压（0.1~5兆帕）色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，并收集流份，按监控图出现的谱峰收集，再以薄层色谱（TLC）检识辅助，取TLC检测紫色斑点中Rf值一致的流份，合并流分后得到六个粗的化合物。

5、将中低压（0.1~5兆帕）制备色谱上串联的2根柱子换成C₁₈柱、将六个粗品化合物分别用甲醇溶解，注入C₁₈柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脱，收集流分，蒸干，六个化合物得到进一步的纯化，经高压液相色谱检测六个化合物的质量分数为95%以上。

6、六个化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性，说明为萘醌成分（碱性反应的方法25%（w/v）Na₂CO₃水溶液；4%（v/v）HCHO水溶液；5%（v/v）邻二硝基苯的苯溶液各1滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加热至温度在50～70℃，1～4分钟内产生紫蓝色。无色亚甲蓝显色试验，在薄层色谱TLC的板上用无色亚甲蓝溶液喷雾，板子上出现蓝色的斑点）。

7  经核磁共振谱、红外、质谱分析确证六个单体分别为去氧紫草素(deoxyshikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β-羟基异戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)；异丁酰紫草素