[发明专利]检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测漆酶吸附特性的方法。

背景技术

木质素是农作物秸杆及城市生活垃圾中一种常见的、难降解的物质，处理不当会造成极大的资源浪费和环境污染。白腐菌是降解木质素一类有机污染物能力最强的微生物，它在分解木质素的过程中会产生氧化及分解木质素的酶系统，主要包括木质素过氧化物酶（Lignin Peroxidases）、锰过氧化物酶（Manganese Perxidases）和漆酶（Laccase）。它们决定着木质素降解的途径、速度和程度，因此木质素降解过程中微生物的酶解作用便成为关键。

木质素的组成单位和空间结构决定了其酶解过程的复杂性，而酶在木质素表面的吸附是酶降解底物的第一步。木质素组成成分复杂，各成分对酶的吸附特性不一，在生产中，酶液与底物的合理比例关系就是依据酶在底物上的吸附特性而确定的，因而酶的吸附特性对工业化生产也具有指导作用，可为设计和选择生化反应器提供最优参数。这样通过实时监测不同基质条件变化下木质素降解酶的吸附作用位点来检测其吸附特性，对深入了解木质素降解酶的作用机制，促进木质素的酶解作用显得尤为重要。

首先，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是在既限碳，又限氮条件下产生的严格次级代谢产物，碳、氮源营养物的存在会限制细胞对酶的分泌；其次，由于木质素过氧化物酶和锰过氧化物在降解有机污染物时需要大量的H₂O₂辅助剂，这在现实情况下很难实现，限制了其在实际生产中的应用；第三，漆酶具有780mV氧化还原电位，能把分子氧直接还原为水，即使没有H₂O₂和其它次级代谢产物存在下，也可催化有机污染物的氧化。因此，漆酶的吸附特性检测更具实际意义。

目前对于漆酶的吸附特性研究普遍停留在酶的吸附热力学、测定吸附等温线和建立吸附热力学模型以及测定和建立酶解动力学等基础工作上，因此研究一种通过微观定位酶的吸附作用位点来检测其吸附特性的方法，成为极需解决的的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种成本低廉、操作方便且能够特异性地检测漆酶的吸附位点及数量，实现检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法，包括以下步骤：

向碱木质素溶液中，添加漆酶—胶体金探针和ABTS【2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐】，所述漆酶—胶体金探针包括漆酶，所述漆酶表面结合有粒径为15 nm～20 nm、Zeta电位为-30.5 mV～-35.5 mV的胶体金颗粒，调节pH值为4.0～5.0，调节溶液中漆酶—胶体金探针的酶活性浓度不小于20 U/g，ABTS的添加量为5 mg/L～20 mg/L，在30℃～40℃温度条件下振荡培养4～6天后，离心并取上清液真空冷冻干燥后，电镜水平检测漆酶—胶体金探针吸附于碱木质素的位点及吸附量，完成对漆酶吸附特性的检测。

作为本发明的方法的进一步改进：

上述的方法中，所述离心的工艺参数优选为：转速为9000 r/min，温度为4℃条件下离心至少10 min。

上述的方法中，所述振荡培养的条件优选为：摇床转速为150～200 r/min。

上述的方法中，所述漆酶—胶体金探针是通过以下步骤制备得到的：

制备胶体金溶液并将其pH 值调节为4.5～5，向胶体金溶液中加入质量浓度不小于0.9 mg/mL的漆酶溶液，在搅拌条件下加入质量浓度为5 mg/mL～10 mg/mL的PEG-20000溶液，所述胶体金溶液、漆酶溶液与PEG-20000溶液的体积比为5∶（1.1～1.15）∶（0.6～0.65），充分反应后，用1000 r/min～1200 r/min的转速进行第一次离心，去除聚集物，再以13000 r/min ～15000 r/min的转速进行第二次离心，吸弃上清液，将沉淀重溶于柠檬酸钠缓冲溶液，定容，制得所述漆酶—胶体金探针。

上述的方法中，所述柠檬酸钠缓冲溶液中含有浓度为0.2 mg/mL的PEG-20000。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明的检测碱木质素酶解过程中漆酶吸附特性的方法，成本低廉、操作方便，能够适应底物条件变化，特异性地检测漆酶的吸附位点及数量，能为酶液与底物的合理比例关系的确定提供依据，可为设计和选择生化反应器提供最优参数。

附图说明