[发明专利]食物过敏原检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食物过敏原检测试剂盒及其制备方法，属于酶联免疫检测技术。

背景技术

机体对某种食物过敏时，会在体内产生特异性抗体，能特异性结合食物中导致过敏的成份——过敏原。

目前，临床上常采用检测特异性抗体的种类来确定患者食物过敏的类型，而酶联免疫吸附实验是常用的检测方法。

传统的食物过敏酶联免疫检测法通常采用的都是直接包被模式，即由生产厂家预先将过敏原固相化于作为载体的聚苯乙烯微孔板上，供检测人员直接使用。然而，食物过敏的种类很多，同一患者可对多种食物过敏，但存在个体差异。在检测时往往需要同时进行多种过敏原的检测，而每一个患者所需的检测组合又各不相同。传统试剂常常由生产厂家将多种过敏原同时包被于微孔板制成类似套餐性质的检测组合，由于采用直接包被法，组合方式将无法改变。而实际工作中，每一患者的检测需要各不相同，食物过敏组合是个性化的，往往与厂家提供的项目组合产生冲突，造成多余的检测和漏检，同时会增加检测成本。

链霉亲和素与生物素系统，是基于生物素与链霉亲和素相结合这一特性所建立的体系称为生物素-亲和素系统。

生物素（biotin，B）分子量为244. 31，现已能人工合成，制备方便。生物素基本结构为双环结构：I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的部位；II为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体、酶等。生物素与生物大分子结合后并不影响生物分子和生物素原有的生物活性，即生物素标记抗体同时具备与亲和素和相应抗原结合之特性。链霉亲合素( streptavidin，SA) ，分子量65KD ，由四条相同的肽链组成，一个链霉亲合素分子能结合四个生物素分子。与亲和素相比，链霉亲和素对生物素具有高度亲和力（亲和常数为10¹⁵/mol），与生物素结合后形成非常稳定复合物，很难解离。

发明内容

本发明就是为了克服直接包被模式制备的食物过敏酶标反应板，无法满足患者个性化需求的不足，而提供一种灵活选择所需过敏原，包被和检测过程同步进行的食物过敏原检测试剂盒及其制备方法。

本发明的设计原理是引入生物素-亲和素间接包被模式，对酶标反应板的包被制作环节进行改进，过敏原不需预先包被，而是标记上生物素，同包被了亲和素的微孔反应板同时提供给使用者，检测人员根据被检者的具体情况灵活选择所需过敏原并可同血清一道加入微孔板，实现即时包被，并且包被和检测过程同步进行。

本发明是按以下技术方案设计的。

一种食物过敏原检测试剂盒的制备方法，包括显色液A、显色液B，终止液，酶标抗IgE抗体，该试剂盒还包括包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯乙烯微孔板，多种分别生物素化过敏原，其中：

a.包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯乙烯微孔板，是在聚苯乙烯微孔板上，每孔加入稀释液Ⅰ稀释的浓度为3-5μg/ml的生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液150μl，甩净后用稀释液Ⅰ洗板，甩净，拍干；每孔再加入稀释液Ⅱ稀释的浓度为3-5μg/ml的链霉亲和素包被缓冲液 150μl，温浴，甩净，用稀释液Ⅱ洗板，甩净，拍干；每孔加入封闭溶液体积250μl，温浴过夜，甩净，拍干备用；

b.多种生物素化过敏原，即将多种纯化的特异性抗体的过敏原分别用0.1mol/L，pH9.5的NaHCO₃缓冲液透析，过夜并于280nm处测吸光度值，计算抗体总量；另将多种活化的生物素分别溶于二甲基甲酰胺，按照生物素与过敏原的摩尔比为15-20:1的比例将二者混合反应1h，反应后的液体分别再用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液4℃透析24小时，分装于试剂瓶中备用。

所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其多种纯化的特异性抗体的过敏原分别是牛奶过敏原，鸡蛋过敏原，虾蟹过敏原，小麦过敏原，花生过敏原等。

所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其稀释液Ⅰ是按以下重量百分比的原料制备的：

三羟甲基氨基甲烷（Tris）         6.06 g（0.606g/100ml）

氯化钠（NaCl）                   8.77 g（0.877g/100ml）

Proclin 300                        0.5ml（0.05ml/100ml）

双蒸水（ddH₂O）  950 ml 调pH=8.0 加0.5 ml Procilin 300  定溶至1000 ml。