[发明专利]利用产毒镰孢菌生产T-2和HT-2毒素的方法

权利要求书

1.利用产毒镰孢菌生产T-2和HT-2毒素的方法，包括产毒培养的步骤，其特征在于产毒培养的条件包括：使用Richard液体培养基为产毒培养基，培养温度5℃～20℃，光照培养与暗培养每24小时交替、先振荡培养再静置培养相结合的方式，共培养8～10天。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养温度为5℃和20℃交替，每24h变换温度。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的振荡培养摇床转速为80r/min。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述的振荡培养占总培养时间的45～55％。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的Richard液体培养基为蔗糖25g，酵母浸出膏3g，磷酸二氢钾6g，7水合硫酸镁2g，氯化镁0.02g，无菌水1000mL，经121℃，1.0kPa高压灭菌30min。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于还包括产毒培养前筛选产毒镰孢菌的步骤。

7.权利要求1所述的方法，其特征在于还包括产毒培养后提取培养产物的步骤。

8.权利要求1所述的方法，包括如下步骤：

①筛选产毒镰孢菌：将待检测镰孢菌接入GYM液体培养基中，25℃恒温培养3～5天，采用微电钻基因组DNA快速提取法提取镰孢菌基因组DNA，以HATri/F(CAGAT GGAGA ACTGGA TGGT)和HATri/R(GCACA AGTGCCACGT GAC)特异性引物对对待检测镰孢菌基因组DNA进行特异性PCR，采用25uL PCR反应体系，tri5-PCR扩增条件是：

94℃75s  1循环；

94℃ 15s、62℃ 15s和72℃ 45s程序循环40次；

72℃ 4min15s 1循环，

2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，所得条带明亮的镰孢菌菌株为产毒镰孢菌；

②产毒培养：产毒培养基培养8～10天，所述的：

产毒培养基为Richard液体培养基：蔗糖25g，酵母浸出膏3g，磷酸二氢钾6g，7水合硫酸镁2g，氯化镁0.02g，无菌水1000mL，经121℃，1.0kPa高压灭菌30min；

培养温度为5℃和20℃交替，每24h变换培养温度；

光照培养与暗培养每24小时交替；

先振荡培养再静置培养，振荡培养占总培养时间的45～55％，摇床转速为80r/min；

③培养产物提取：

超声处理产毒培养产物30min后，过滤，滤液过T-2免疫亲和柱，然后以蒸馏水清洗免疫亲和柱，之后以甲醇洗脱毒素。