[发明专利]利用产毒镰孢菌生产T-2和HT-2毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及T-2毒素和HT-2毒素的生产方法。尤其是利用产单端孢霉烯族毒素镰孢菌来生产T-2毒素和HT-2毒素的方法。

背景技术

T-2毒素属于A型单端孢霉烯族毒素，是一种倍半萜烯类化合物，其结构式如式I所示：

HT-2毒素为T-2毒素的代谢产物。T-2毒素主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结等，抑制这些器官细胞蛋白质和DNA合成，而且能引起淋巴细胞中DNA单链的断裂，此外，T-2毒素还可作用于氧化磷酸化的多个部位而引起线粒体呼吸抑制。T-2毒素和HT-2毒素是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，能通过食物形式从口进入或存在于空气中经呼吸道进入有机体中，对人畜危害极大。

正是由于T-2毒素对人类和动物的巨大危害，使得人们对不论是T-2毒素与人类疾病的关联方面，还是各种食品中毒素含量的限定和检测都投入了极大地关注。这就意味着在科研工作中需要大量的粗毒素，但是现在市场购买毒素存在着价格昂贵且购置时间长等问题，从而限制了T-2毒素的相关问题的研究，因此，获得大量、廉价的T-2毒素具有特别重要的科学研究意义和实际应用价值。

自然界中许多农作物的致病菌都能产生T-2毒素，其中大部分来自于镰孢菌属，主要产生T-2毒素的镰孢菌有拟枝孢镰孢、梨孢镰孢、禾谷镰孢和木贼镰孢等。许多研究者的研究结果表明，产毒培养条件，如光照、培养方式等之间存在明显的交互作用，会严重影响菌株的毒素产量。许多研究者的实验是基于单因素变量的研究，无法准确地测定各条件之间的最佳作用条件。本发明人试图寻找一种综合的最佳产毒培养方法，满足生产需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用产毒镰孢菌生产T-2和HT-2毒素的方法，尤其是使具有产单端孢霉烯毒素能力的镰孢菌产生目标毒素的产毒培养方法。

本发明所述的利用产毒镰孢菌生产T-2和HT-2毒素的方法，包括产毒培养的步骤，所述产毒培养的条件包括：使用Richard液体培养基为产毒培养基，培养温度5℃～20℃，光照培养与暗培养每24小时交替、先振荡培养再静置培养相结合的方式，共培养8～10天。

上述技术方案中，优选的培养温度模式是5℃和20℃交替，每24h变换温度。

上述本发明的任一技术方案中，优选的振荡培养方式是使用摇床培养，摇床转速为80r/min；作为进一步的优选技术方案，振荡培养占总培养时间的45％～55％。最为优选的，使用智能型光照培养箱及上海智城分析仪器公司生产的型号为ZHWY211B的大容量恒温摇床完成上述技术方案的操作；当然，本领域的技术人员可知，根据该仪器所确定的参数条件，比如光照强度等，选择其它适当的仪器进行生产也是可以的。

本发明的上述技术方案中，所述及的Richard液体培养基为蔗糖25g，酵母浸出膏3g，磷酸二氢钾6g，7水合硫酸镁2g，氯化镁0.02g，无菌水1000mL，经121℃，1.0kPa高压灭菌30min。

上文所述的本发明的技术方案是针对产毒镰孢菌的产毒生产方法的技术方案，该方法适用于所有具有产毒能力的镰孢菌生产T-2和HT-2毒素。因此，在使用本发明的方法进行产毒培养之前，应当包括产毒培养前筛选产毒镰孢菌的步骤。筛选方法参考王雅玲等在“养殖环境中真菌气溶胶及相关真菌毒素的检测”(山东农业大学.2006.)一文中述及的方法。具体的方法是：将待检测镰孢菌接入GYM液体培养基中，25℃恒温培养3～5天，采用微电钻基因组DNA快速提取法提取镰孢菌基因组DNA，以HATri/F(CAGAT GGAGA ACTGGATGGT)和HATri/R(GCACAAGTGC CACGT GAC)特异性引物对对待检测镰孢菌基因组DNA进行特异性PCR，采用25uL PCR反应体系，tri5-PCR扩增条件是：

94℃75s  1循环；

94℃ 15s、62℃ 15s和72℃ 45s程序循环40次；

72℃ 4min15s 1循环，

2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，所得条带明亮的镰孢菌菌株为产毒镰孢菌。

上文所述的本发明的技术方案所得到的培养物是包含了目标毒素的混合物，因此，优选的技术方案中还包括产毒培养后提取培养产物的步骤。参考隋凯等所著“谷物中T-2毒素的检测”(中华人民共和国卫生部，GB/T5009.118-2008.)进行，具体操作包括超声处理产毒培养产物30min后，过滤，滤液过T-2免疫亲和柱，然后以蒸馏水清洗免疫亲和柱，之后以甲醇洗脱毒素。