[发明专利]表达NY-ESO-1重组耻垢分枝杆菌的制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物学和基因工程学领域，具体而言涉及一种表达肿瘤/睾丸抗原NY-ESO-1的耻垢分枝杆菌、其制备及该重组耻垢分枝杆菌在免疫治疗肿瘤中的应用。

背景技术

耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)是一种非典型的分枝杆菌，与典型的分枝杆菌BCG相比，耻垢分枝杆菌生长快速，对人、小鼠、豚鼠等动物均无致病性，作为一种细菌疫苗载体有着广阔的应用前景。

BCG作为浅表性膀胱癌的免疫辅助治疗已有很长的历史，但活的BCG仍存在毒性，有可能引起结核杆菌的感染，尤其对免疫缺陷型的病人存在很大的危害。初步研究表明无细胞耻垢分枝杆菌疫苗具有良好的免疫调节作用，对结核分枝杆菌(MTB)感染的豚鼠具有明显保护效果，并具有较高安全性，目前已进入II期临床研究[1]。此外，耻垢分枝杆菌单位时间内的分泌型蛋白产量是BCG的50-100倍。因此，以耻垢分枝杆菌作为一种低成本且有效的疫苗载体表达外源抗原已成为目前疫苗研究中的热点。

Jae-Sung Yu等[2]研究了表达HIV-1蛋白的重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫作用，结果表明经重组耻垢分枝杆菌免疫的小鼠成功产生了HIV抗体及特异的T淋巴细胞反应及IFN-γ。Lin Lu等[3]构建了表达人幽门螺杆菌26K外膜蛋白(OMP6)的重组耻垢分枝杆菌，经该重组耻垢分枝杆菌免疫后的小鼠对幽门螺杆菌的感染产生了明显的免疫保护作用，其肠道中幽门螺杆菌菌落急剧减少，由此该作者认为该重组耻垢分枝杆菌可作为一种低成本的、有效的针对幽门螺杆菌的联合疫苗。

NY-ESO-1抗原是肿瘤-睾丸抗原家族中的重要成员，在多种肿瘤细胞上表达，包括黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和膀胱癌，并且是迄今发现的最具免疫原性的肿瘤抗原之一。

NY-ESO-1抗原可在NY-ESO-1表达阳性的肿瘤患者体内引起自发性体液免疫反应和特异性T细胞免疫反应[4]，因此该抗原被认为是目前最好的肿瘤候选疫苗之一，在肿瘤免疫治疗中颇具发展潜力。

目前，针对NY-ESO-1的多肽疫苗大多是基于它的不同表位(如p156-167、p157-160、p157-170)，人工合成这些抗原肽或者将这些抗原肽与伴侣蛋白(如HSP)融合作为疫苗进行研究。

然而，本领域中仍然迫切需要开发出更有效的NY-ESO-1的多肽疫苗，以获得更为显著的免疫效果。

发明内容

本发明的目的之一是提供带有NY-ESO-1基因的分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒，其可将NY-ESO-1分别与β-半乳糖苷酶信号肽及全序列融合表达。

本发明的另一个目的是提供一种能将肿瘤/睾丸抗原NY-ESO-1锚定表达在细胞壁或细胞膜上的耻垢分枝杆菌工程菌株。

本发明的再一个目的是提供了该工程菌株在肿瘤免疫治疗中的应用。采用本发明重组耻垢分枝杆菌免疫对象，可在对象体内提高抗原NY-ESO-1的提呈及诱发机体产生细胞、体液免疫反应，进而杀伤表达NY-ESO-1的肿瘤细胞，起到预防和/或治疗肿瘤的效果。

在本发明的第一方面中，提供了一种用于重组肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1蛋白表达的质粒，所述质粒包含：

(a)β-半乳糖苷酶信号肽编码序列或β-半乳糖苷酶编码序列；和

(b)NY-ESO-1编码序列。

在本发明的一个实施方式中，所述重组NY-ESO-1蛋白是β-半乳糖苷酶信号肽序列与NY-ESO-1的融合蛋白、或β-半乳糖苷酶全长序列与NY-ESO-1的融合蛋白。

在一个优选例中，所述融合蛋白定位于重组耻垢分枝杆菌的细胞壁或细胞膜上，优选细胞壁上。

在另一个优选例中，所述融合蛋白中的β-半乳糖苷酶信号肽序列或全长序列与NY-ESO-1直接相连或通过连接肽序列相连，优选所述连接肽的长度为1～30个氨基酸残基，优选5～25个氨基酸残基，更优选10～23个氨基酸残基。

在另一个优选例中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的序列，优选为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的序列。