[发明专利]一种基于免疫磁珠富集的甲型流感病毒检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：

A、免疫富集反应体系组分：标记甲型H1N1流感病毒特异性单克隆抗体的免疫磁珠，直径：100-300 nm；工作稀释浓度：1:10-1:20；0.1 M 磷酸盐缓冲液pH 7.2- pH 7.4；无菌超纯水；

B、环介导的等温核酸扩增体系组分：Bst DNA聚合酶、10×Bst DNA聚合酶缓冲液、AMV反转录酶、Calcein 、 dNTP 、Betaine、MgSO4、10×引物混合物：F3: 2 μM；B3: 2 μM；FIP: 16 μM；BIP: 16 μM；Loop-1: 8 μM；Loop-2: 80 μM；

C、抗体的制备：采用标准B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗甲型H1N1流感病毒的单克隆抗体，并用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对制备出的抗体进行纯化 ；

D、免疫磁珠的制备：选用直径为100-300 nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺和琥珀酰亚胺共价偶联的方式将甲型H1N1流感病毒单克隆抗体共价交联到超顺磁颗粒上，交联后的超顺磁颗粒用BSA封闭；

E、设计甲型H1N1流感病毒的特异性引物，用于环介导的等温65oC扩增反应，包括两条外引物F3、B3、两条内引物FIP、BIP以及两条环结合引物Loop1、Loop2，序列分别如下：

F3：CCGGAGACAAAATAACAT；

      B3: GTATATTCTGAAATGGGAG；

      FIP: GATCGAGCATTTCCTTCCAAAGCATCTGGAAATCTAGTGG；

      BIP: TCAGTACACCAGTCCACGATTGCTGTTTATAGCTCCCTTG；

      Loop1: GCAATACAACTTGTCAAACACC；

      Loop2: TGCGAATGCATATCTCGGT。

2.权利要求1所述的一种甲型H1N1流感病毒的检测方法，其步骤是： 

A、免疫富集：利用标记甲型H1N1流感病毒特异性单克隆抗体的磁珠富集标本中的甲型H1N1流感病毒，富集后产物经PBS缓冲液洗涤1-2次，用无菌水重悬待用；

B、热裂解上述产物、经磁力架分离，将含有病毒核酸的上清作为环介导等温扩增反应的模板；

C、环介导等温扩增反应: 建立环介导等温扩增反应体系，65oC孵育30 min；

D、结果判定：肉眼观察到白色沉淀和有绿色荧光产生即为阳性，反之则为阴性。