[发明专利]一种基于免疫磁珠富集的甲型流感病毒检测试剂盒及方法

说明书

技术领域           

本发明属于生物技术应用领域，更具体涉及一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，同时还涉及一种甲型H1N1流感病毒的检测方法，可应用于各级疾病预防控制机构，流感监测网络实验室，哨点医院等对发热病人鼻咽拭子等标本的甲型H1N1流感病毒的检测和监测。 

背景技术

2009年3月墨西哥爆发“人感染猪流感”疫情，造成人员死亡。研究发现，此次疫情的病原为变异后的新型甲型H1N1病毒，包括猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。该病毒具有较强的传染性、可通过近距离飞沫和接触传播。临床主要表现为流感样症状，少数病例病情重，进展迅速，可出现病毒性肺炎，合并呼吸衰竭、多脏器功能损伤，严重者导致死亡。目前，甲型H1N1流感疫情已在全球较大范围内传播，这场持续了一年多的疫情造成约1.85万人死亡，出现疫情的国家和地区达到了214个。截止至2010年3月31日，中国31个省份累计报告甲型H1N1流感确诊病例12.7余万例，，死亡病例800例。

已有的甲型流感病毒监测方法主要包括病毒分离培养、病毒核酸检测和血清学检查。其中病毒分离培养费时费力，无法满足疾病流行期间同时处理大量标本的需要，而甲型流感病毒特异性中和抗体在体内的产生大约需要1-2周，因此血清学的检查无法实现早起诊断的目的。目前最为常见的诊断方法是病毒核酸检测，通常是用RT-PCR法在检测呼吸道标本，尽管该方法灵敏度高，检测时间短，但是需要昂贵的实时定量PCR仪，很难在偏远、贫穷的地市普及。近年来发展的环介导等温扩增技术在病毒检测方面已发挥较大的优势，主要体现在可操作性、设备要求等方面。然而目前所有的核酸检测方法都需要借助商业化试剂盒提纯临床样本中的核酸后才能进行体外扩增，否则很容易产生假阴性，降低弱阳性临床标本的检出率。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒， 该试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，可广泛应用于各级疾病预防控制机构，流感监测网络实验室，哨点医院等对发热病人鼻咽拭子等标本的甲型H1N1流感病毒的检测和监测。

本发明的另一个目的是在于提供了一种甲型H1N1流感病毒的检测方法，该方法无需单独的核酸提纯步骤，借助一个水浴锅，即可实现复杂样本中甲型H1N1流感病毒的快速、高灵敏检测。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，试剂盒包括以下部分：

用于特异性富集检测样本中甲型H1N1流感病毒的免疫磁珠及所需溶液；用于扩增检测样本中甲型H1N1流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。具体组分如下：

A、免疫富集反应体系组分： 标记甲型H1N1流感病毒特异性单克隆抗体的磁珠（直径：100-300 nm；工作稀释浓度：1:10-1:20）；0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS） pH 7.2- pH 7.4； 无菌超纯水

B、环介导的等温核酸扩增体系组分：  Bst DNA聚合酶（8 U/μl，New England Biolabs）、10×Bst DNA聚合酶缓冲液（New England Biolabs）、AMV反转录酶（10 U/μl，Invitrogen）、Calcein (0.5 mM, Sigma-Aldrich )、 dNTP (10 mM , Takara)、Betaine（250 mM, Sigma-Aldrich）、MgSO₄（150 mM, 国产分析纯）10×引物混合物（F3: 2 μM；B3: 2 μM；FIP: 16 μM；BIP: 16 μM；Loop-1: 8 μM；Loop-2: 80 μM）。

试剂盒组分制备方法: