[发明专利]脱细胞干燥活性羊膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医用材料领域，具体地涉及一种可长期保存的脱细胞干燥活性羊膜及制备方法。

背景技术

羊膜来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管且具有韧性的组织，是人体中最厚的基底膜，20世纪初，临床上最早应用羊膜于烧伤和溃疡面的修复，20世纪40年代DeRoth将羊膜用于结膜缺损的治疗，开启了羊膜应用于眼科的历史。直到1995年Kim和Tseng将保存的羊膜成功用于角膜表面的重建后，羊膜在眼科的应用才加速发展起来。

目前临床上采用的羊膜主要为临时剥离处理的新鲜羊膜，或者经过预处理的深低温保存羊膜。两者均不能做到随取随用。目前还有一种技术是将羊膜预处理后真空冷冻干燥，灭菌包装储存，该种方式能够做到随取随用，延长保存期到1-3年。

但是目前公开的几种冷冻干燥生物羊膜的预处理过程均存在问题，专利公开号为CN 1644047A的生物羊膜制品冻干前未经过脱细胞处理，不能保证产品在临床应用时可能会发生的免疫原性反应，而专利公开号为CN 1757717A的“干燥活性羊膜的制备方法：描述的羊膜制备，虽然采取了脱细胞处理，但是采用的是胰蛋白酶和EDTA混合液化学方法进行脱细胞，根据文献以及本公司实验数据标明，胰蛋白酶对基质的破坏作用强，会对纤维造成损伤，致使纤维排列松散紊乱，以及断裂，羊膜基质的力学性能大大降低，影响羊膜的临床使用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种脱细胞干燥活性羊膜的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种脱细胞干燥活性羊膜的制备方法，由如下步骤组成：

(1)原料处理：取通过病原体检测后正常的足月剖腹产术后的人胎盘，用无菌生理盐水清洗，除去血液成分，将羊膜从胎盘绒毛膜上完整钝性分离，用细胞刮匙刮除羊膜基质面附着的基质成分；

(2)反复冻融：将步骤(1)处理后的羊膜于-60℃～-80℃冷冻2～6h，于37℃水浴融化10～40min，如此反复1～5次；

(3)清洗：将步骤(2)处理后的羊膜浸入PBS液中，于4℃摇床清洗18～30h，取出浸入去污剂中，于20～40℃，在摇床20～200转/分的速度下振荡18～30h；取出，再浸入PBS液中，于2～10℃，在摇床20～200转/分的速度下振荡40～56h；每8h换一次PBS液；

所述100ml去污剂溶液是用0.15ml～0.35ml的triton X-100，0.15g～0.35g的脱氧胆酸钠溶液，余量为PBS配制而成；

(4)冷冻干燥：将经步骤(3)清洗后的羊膜贴附于无菌的醋酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜上，切成统一尺寸的羊膜片，将羊膜片置于冷冻干燥机中，-40～-60℃冷冻干燥2～48h，除去水分，即获得脱细胞干燥活性羊膜；真空包装并封口；

(5)伽马射线消毒灭菌。

所述步骤(2)反复冻融优选的是：将步骤(1)处理后的羊膜于-70℃冷冻4h，于37℃水浴融化20min，如此反复3次。

所述步骤(3)清洗优选的是：将步骤(2)处理后的羊膜浸入PBS液中，于4℃摇床清洗24h，取出浸入去污剂中，于30℃，在摇床100转/分的速度下振荡24h；取出，再浸入PBS液中，于8℃，在摇床100转/分的速度下振荡48h；每8h换一次PBS液；

所述100ml去污剂溶液是用0.25ml的triton X-100，0.25g的脱氧胆酸钠溶液，余量为PBS配制而成。

本发明采用反复冻融和去污剂联合使用的方法去除羊膜细胞，克服单纯的冻融法脱细胞效果差的不足，能有效脱去羊膜上的细胞，很好地保持组织中胶原的结构和基底膜的完整性，而且保持了较好的力学性能，无细胞毒性。

附图说明

图1为新鲜羊膜组HE染色组织学观察(HE×200)。

图2为胰酶去污剂组HE染色组织学观察(HE×200)。

图3为本发明的一种脱细胞干燥活性羊膜组HE染色组织学观察(HE×200)。

图4为新鲜羊膜组，胰酶去污剂组和反复冻融去污剂组羊膜的最大张力，断裂伸长率和弹性模量的对比图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明所使用的PBS液为磷酸盐缓冲液。triton X-100为一种非离子表面活性剂。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种脱细胞干燥活性羊膜的制备方法，包括如下步骤：