[发明专利]人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法

权利要求书

1.人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：

所述的液相芯片包含有：

（1）扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24：

引物1-12的序列分别为SEQ ID NO.1-12，扩增包括1a、1b、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、11w和8w在内的六个目标片段；

引物13-24的序列分别为SEQ ID NO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w和14w在内的六个目标片段；

（2）用于区分22种SNP位点的特异性连接探针25-46，序列分别为SEQ ID NO.25-46，每个探针是针对每一个SNP位点的前后相邻的两个寡核苷酸片段，即前端连接探针和后端连接探针；

（3）分别包被有对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68的荧光编码微球。

2.根据权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：

所述的前端连接探针的末位碱基为区别SNP突变的碱基，前端连接探针的首位碱基标记有生物素，后端连接探针的首位碱基有磷酸化修饰，在碱基完全匹配的情况下有耐热连接酶将前端后端连接探针进行共价连接，形成首位碱基有标记有生物素的多碱基核苷酸链。

3.根据权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：

所述的对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68，分别选自HPA1 HPA2 HPA3 HPA4 HPA5 HPA15 HPA6 HPA7 HPA8 HPA9 HPA10 HPA11 HPA12 HPA13 HPA14 HPA16抗原决定基因碱基突变位点两侧序列，包括特异序列、连续10个T碱基间隔序列及修饰合成的氨基。

4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：采用两组扩增引物1-24在两个扩增管中对检测DNA样本进行多重PCR扩增，并将两管中的产物进行等量混合，获得包含有22种SNP位点所在的目的片段；

步骤二：以上述获得的扩增产物为模板，用连接探针25-46在同一管中进行多重连接反应，获得样品中存在的代表各基因型的单链连接产物；

步骤三：连接产物同包被有特异性探针47-68的荧光微球进行杂交反应，随后通过连接产物前端碱基上标记的生物素和链亲和素-藻红蛋白荧光标记分子反应，从而形成荧光微球-特异性探针-单链连接产物-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物；

步骤四：通过流式荧光检测仪进行信号阅读。

5.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：

所述的步骤一中的扩增温度为95℃，变性3分钟，95℃－30s 52℃－30s 72℃－30s 5 个循环，95℃－30s 55℃－30s 72℃－30s 30个循环，72℃延伸1分钟；

PCR扩增使用的酶为taq聚合酶。

6.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：

所述的步骤二中的连接反应，其反应体系包括1X thermo stable ligase reaction buffer，两管多重扩增产物各1μl, 连接探针各0.2μM, thermo stable ligase 4U,总体积为20μl；连接温度为95℃，变性3分钟，95℃－30s 60℃－30s 30个循环； 

连接反应使用的连接酶为90N耐热连接酶。

7.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：

所述的步骤三中的杂交反应为，将液相芯片放置于室温下静置30分钟平衡温度；微球于振荡器上震荡30秒，充分悬浮微球；取微球20μl置于杂交反应室内；每个反应加入连接产物1.5μl；贴上合适的封板纸，并于振荡器上震荡10秒钟充分混匀；置于控温器上，设置并运行如下温度程序：94℃  3  min 50℃  30 min，此运行时按照80μl/反应的体积准备荧光素，并孵育至温度为50℃，同时请将Luminex加热装置设定为52℃，运行结束后每孔加入荧光素80μl,并继续在50℃下孵育10分钟。