[发明专利]人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法。

背景技术

血小板输注是预防和治疗因血小板减少或功能异常而引发的出血性疾病的重要手段。由于目前人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）分型技术的局限性，临床输注血小板时多考虑ABO血型，而忽视了血小板血型相配合的问题。血小板血型不配合可引发一系列临床同种免疫症状的出现，如新生儿同种免疫血小板减少症（NAIT）、输血后紫癜（PTP）及血小板输注无效（PTR）等。建立一种新型、高效且实用的HPA分型技术，为患者提供相配合的血小板，对于促进临床血小板输注的安全性和有效性无疑具有重要意义。

HPA是由血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，其基因具有单核苷酸多态性（SNP）。目前已发现有24个血型抗原，被国际血小板命名委员会（PNC）正式命名的HPA有22个，其相应基因遗传多态性的分子基础也被阐明。这些HPA系统的共同特点是：常染色体显性遗传，多数已证实由共显性双等位基因控制，在cDNA序列中仅有1～2个碱基的差别而导致翻译时1个氨基酸的不同。随着HPA分子生物学特性的不断阐明，HPA基因分型成为可能。

长久以来，HPA分型一直采用血清学方法，如混合被动血凝试验（MPHA）、血小板抗原单克隆特异性抗体固定试验（MAIPA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA）等。由于这些方法所需的一些抗血清，如抗2a和抗3b等，都难以获得，加之在一些NAIT、PTP或PTR患者中较难得到足够的血小板用于血清学试验，人们一直考虑用一种更有效、实用的方法来取代血清学试验。进入上世纪90年代后，随着分子生物学技术的不断发展和对HPA基因结构研究的突破性进展，使得HPA基因分型成为可能。到目前为止，主要有以下几种HPA基因分型方法：聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）、DNA序列分析、聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（PCR-ASO）、聚合酶链反应-限制性片断长度多态性分析（PCR-RFLP）、固相基因芯片，其检测的准确性、敏感性、简便性及线性范围等方面均有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确性、敏感性和灵活性更高的人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法，可对目前正式命名的22种人类血小板抗原型别一次性检测，以克服目前的人类血小板抗原基因分型技术中存在的通量低、准确度和灵敏度较差的问题。

本发明所采用的技术方案是：

人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：

所述的液相芯片包含有：

（1）扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24：

引物1-12的序列分别为SEQ ID NO.1-12，扩增包括1a、1b、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、11w和8w在内的六个目标片段；

引物13-24的序列分别为SEQ ID NO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w和14w在内的六个目标片段；

（2）用于区分22种SNP位点的特异性连接探针25-46，序列分别为SEQ ID NO.25-46，每个探针是针对每一个SNP位点的前后相邻的两个寡核苷酸片段，即前端连接探针和后端连接探针；

（3）分别包被有对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68的荧光编码微球。

所述的前端连接探针的末位碱基为区别SNP突变的碱基，前端连接探针的首位碱基标记有生物素，后端连接探针的首位碱基有磷酸化修饰，在碱基完全匹配的情况下有耐热连接酶将前端后端连接探针进行共价连接，形成首位碱基有标记有生物素的多碱基核苷酸链。

所述的对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68，分别选自HPA1 HPA2 HPA3 HPA4 HPA5 HPA15 HPA6 HPA7 HPA8 HPA9 HPA10 HPA11 HPA12 HPA13 HPA14 HPA16抗原决定基因碱基突变位点两侧序列，包括特异序列、连续10个T碱基间隔序列及修饰合成的氨基。

如所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：采用两组扩增引物1-24在两个扩增管中对检测DNA样本进行多重PCR扩增，并将两管中的产物进行等量混合，获得包含有22种SNP位点所在的目的片段；