[发明专利]一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法

权利要求书

1.一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于：所述试剂由A液、B液等体积混合或A液、B液、C液等体积混合而成，其中：

A液由半合成截短侧耳素衍生物和0.01MPBS混合而成，混合液中半合成截短侧耳素衍生物的质量-体积百分比浓度为0.5％-1.5％；

B液由喹诺酮类衍生物和0.01MPBS混合而成，混合液中喹诺酮类衍生物质量-体积百分比浓度为0.5％-1.5％；

C液由四环素类衍生物和0.01MPBS混合而成，混合液中四环素类衍生物的质量-体积百分比浓度为0.25％-0.75％；

2.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于：所述A液、B液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物的质量比为3∶2；所述A液、B液、C液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物和四环素类衍生物的质量比为3∶2∶1。

3.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于：所述半合成截短侧耳素衍生物选用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。

4.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于：所述喹诺酮类衍生物选用抗生素恩诺沙星或麻保沙星或单诺沙星。

5.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于：所述四环素类衍生物选用多西环素或二甲胺四环素。

6.一种使用权利要求1所述的清除试剂清除细胞培养中支原体污染的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、支原体检测：

(1)提取细胞培养物中基因组DNA；

(2)将步骤(1)中提取的基因组DNA放入待测试管，使用设计的支原体检测简并引物，使用PCR方法扩增提取的基因组DNA目的片段，所述检测引物为：

支原体属：正向引物5’ACACCATGGGAGYTGGTAAT3’

反向引物5’CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3’

无胆甾原体属：正向引物5’GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3’

反向引物：5’TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3’；

(3)将扩增的PCR产物以2％琼脂糖凝胶上样电泳，凝胶成像系统观察，根据产物片段判断支原体种类；

b、清除剂配置：

(1)取8gNaCl，0.2gKCl，2.87gNa2HPO4·12H2O，0.27gKH2PO4溶于1000ml去离子水或三蒸水，经过121℃高温103Kpa高压灭菌，制成0.01MPBS溶液，在4℃环境下冷藏备用；

(2)取半合成截短侧耳素衍生物溶于0.01MPBS配制成半合成截短侧耳素衍生物质量-体积百分比浓度为0.5％-1.5％的A液，在超静台内经0.22um一次性滤器过滤除菌，分装，避光在-20℃冻存；取喹诺酮类衍生物溶于0.01MPBS配制成喹诺酮类衍生物质量-体积百分比浓度为0.5％-1.5％的B液，在超静台内经0.22um一次性滤器过滤除菌，分装，避光在-20℃冻存；取四环素类衍生物溶于0.01MPBS配制成四环素类衍生物的质量-体积百分比浓度为0.25％-0.75％的C液，在超静台内经0.22um一次性滤器过滤除菌，分装，避光在-20℃冻存；

c、支原体清除

步骤A中所检测出来的支原体种类为同属支原体，将配置好的A液、B液等体积混合，然后加入完全培养基中稀释到一定浓度，培养7-14天，其中细胞培养环境的温度为37℃、5％CO2、20％O2、100％湿度；在培养过程中，每24h换液一次，换液时用0.01MPBS清洗培养容器；步骤A中所检测出来的支原体种类为不同属的混合支原体，A液、B液、C液等体积混合制成清除试剂，然后加入完全培养基中稀释一定浓度，培养7-14天，其中细胞培养环境为温度为37℃、5％CO2、20％O2、100％湿度；在培养过程中，每24h换液一次，换液时用0.01MPBS清洗培养容器。