[发明专利]一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养中支原体污染的清除试剂及其使用方法。

背景技术

支原体是细胞培养中最常见的污染物，会干扰实验结果，但是由于支原体的二分裂时间为1-6小时，所以支原体污染培养细胞后初期不易察觉。在细胞培养中常见的污染支原体来源于口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。培养细胞污染支原体后依不同支原体的抗原性及生化代谢差别而会有不同的致病性，但大致表现是相同的，最开始引起实验者注意的是培养的细胞生长变缓慢，之后培养液很快就变黄，而且细胞生长周期延长，继而在某次传代后出现细胞间大量黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，细胞固缩，最终完全死亡。

在细胞培养中，肿瘤系细胞一般为3n～4n体，分裂时比2n体的原代细胞染色质组蛋白合成量更多。而精氨酸作为组蛋白的主要构成成分，在肿瘤系细胞分裂时所需的精氨酸量更大，所以相较于原代细胞，对支原体更敏感，所以黑点现象在肿瘤系细胞中更容易出现，出现后也更明显。而原代细胞污染支原体后的表现主要是生长缓慢，细胞变形，细胞内出现明显的空泡，逐渐出现巨细胞化及拉网现象，另外，有些悬浮生长的细胞在支原体污染后，除了生长缓慢外，经常出现细胞团集现象。

支原体分类属于柔膜体纲，支原体目，其中能通过0.22um滤膜污染培养细胞的有支原体科和无胆甾原体科两个科，包括支原体属的约80个种和无胆甾原体的8个种中的某些种。由于支原体分类与细菌有差异，故一般用于细菌的抗生素并不能很好的杀灭抑制支原体，由于其种类繁多，故需选用有针对性的广谱抗生素联合用药才能达到最大限度的清除和抑制，而目前并没有研究出能够系统消除支原体污染的试剂及方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法，能够系统的检测出支原体的种类并将清除，可以有效的清除支原体污染，并不会对细胞的本身代谢带来影响。

所述一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于：1.一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于：所述试剂由A液、B液等体积混合或A液、B液、C液等体积混合而成，其中：

A液由半合成截短侧耳素衍生物和0.01MPBS混合而成，混合液中半合成截短侧耳素衍生物的质量-体积百分比浓度为0.5％-1.5％；

B液由喹诺酮类衍生物和0.01MPBS混合而成，混合液中喹诺酮类衍生物质量-体积百分比浓度为0.5％-1.5％；

C液由四环素类衍生物和0.01MPBS混合而成，混合后四环素类衍生物的质量-体积百分比浓度为0.25％-0.75％；

所述A液、B液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物的质量比为3∶2；所述A液、B液、C液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物和四环素类衍生物的质量比为3∶2∶1。

所述半合成截短侧耳素衍生物选用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。

所述喹诺酮类衍生物选用抗生素恩诺沙星或麻保沙星或单诺沙星。

所述四环素类衍生物选用多西环素或二甲胺四环素。

一种使用权利要求1所述的清除试剂清除细胞培养中支原体污染的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、支原体检测：

(1)提取细胞培养物中基因组DNA；

(2)将步骤(1)中提取的基因组DNA放入待测试管，使用设计的支原体检测简并引物，使用PCR方法扩增提取的基因组DNA目的片段，所述检测引物为：

支原体属：正向引物：5’ACACCATGGGAGYTGGTAAT3’

反向引物：5’CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3’

无胆甾原体属：正向引物：5’GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3’

反向引物：5’TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3’；

(3)将扩增的PCR产物以2％琼脂糖凝胶上样电泳，凝胶成像系统观察，根据产物片段判断支原体种类；

b、清除剂配置：

(1)取8gNaCl，0.2gKCl，2.87gNa2HPO4·12H2O，0.27gKH2PO4溶于1000ml去离子水或三蒸水，经过121℃高温103Kpa高压灭菌，制成0.01MPBS溶液，在4℃环境下冷藏备用；