[发明专利]一种中药注射剂致敏原的综合检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学与中药学领域，具体涉及一种中药注射剂致敏原的快速检测方法。

背景技术

中药注射剂系我国特有的现代化中药新剂型，在我国临床上已大量使用。随着中药注射剂临床应用的日益广泛，有关中药注射剂不良反应(ADR)及致死亡病例报道日益增多，过敏反应均为常见的不良反应之一。

中药注射剂引起的过敏反应主要分为I型(速发型)、II型(细胞毒型)、III型(免疫复合物型)、IV型(迟发型)过敏反应。其中，由IgE介导的I型过敏反应是中药注射剂在临床上最常引起的一类过敏反应，其发病急，可迅速出现皮肤潮红、瘙痒、腹痛甚至过敏性休克等严重症状。I型超敏反应是致敏原刺激抗体的淋巴结、肝、脾等器官的单核吞噬系统，触发浆细胞反应产生特异性IgE(sIgE)抗体。IgE分子的Fc端附着在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体上，使机体处于致敏状态。当机体再受同类型致敏原刺激时，致敏原与IgE分子交联，引起肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒化，释放出组胺、白三烯及细胞因子等化学物质产生过敏反应、导致机体的毛细血管扩张、水肿、平滑肌痉挛、内分泌活动亢进，引发过敏性疾病的临床症状，严重时可产生过敏性休克等危及生命。

由于中药注射剂成分复杂，也并不是所有的成分能致敏，而是一部分能与体内蛋白自动结合的成分，可以与血液中蛋白结合，也可能与组织中蛋白结合而致敏，并且中药注射剂的原成分与代谢成分都可能是致敏性成分。

目前的致敏原检测方法主要有皮肤主动过敏试验、全身主动过敏试验、皮肤被动过敏试验、小鼠耳廓肿胀试验(MEST)、啮齿类局部淋巴结实验(LLNA)、Buehler分析法、豚鼠最大值法(GPMT)等，但是这些检测方法仅适用于单成分制剂。怎样确定其中的致敏性成分和测定与其对应的特异性IgE含量方法对于安全使用中药注射剂是大家公认的国际性难题。

目前有人提出将中药注射剂的成分分离并固定，然后再与所产生的抗体酶联免疫反应进行判断，一则小分子的半抗原不好固定，在进行固相酶联免疫吸附法时会被洗脱液洗掉的，故难实现目标；同时中药注射剂致敏原除了与血液中的IgE反应外，还与其它的IgG、IgA、IgM、IgD反应，而后四者并非致敏性免疫球蛋白，因此会受其它的干扰。现又改成单个成分逐个分析法，旨在将中药注射剂中单个成分分离，然后按单成分的模式逐个来试，这对于中药注射剂致敏性动物实验是允许的，但无法进行中药注射剂对人体致敏原研究，因为中药注射剂是整体而不加佐剂使用的，不能将成分折分或加入免疫增强剂来进行研究，这样的实验结果与中药注射剂临床使用的真实情况不一致，因此该法也行不通。另外，如果是中药注射代谢产物产生致敏，现有方法无法进行确定，且对于含量少的成分也可能存在漏查。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中药注射剂致敏原的快速综合检测方法，本发明所述检测方法具有高特异性，适用于多成分的同时检测，能够准确检测出中药注射剂中的致敏原成分，也可最大限度地防止漏查。

本发明的基本思路采用已知成分抗原或抗体去套未知的致敏性多克隆特异性抗体IgE，具体就是：

1)宏观上仍采用酶联免疫吸附反应，中药注射剂致敏是I型超敏反应，标志性指标为免疫球蛋白IgE增加。

2)在采用本法时，要用已知的抗体(抗原)去套人或动物按注射剂使用时所产生的IgE。

3)对于代谢产物或含量少的成分或可能漏查成分采用IgE与吸附中药注射剂指纹图谱弥补；

4)对于与组织内的蛋白结合只能采用药物的半抗原决定簇，通过交叉反应弥补；

5)多成分采用芯片同时测定；

本发明是基于ELISA原理与指纹图谱差异性分析相结合技术，利用固相载体包埋抗原、IgE抗体、抗IgE抗体，分别采用中药注射剂成分抗原与标记好的抗IgE抗体间接酶联免疫反应、包埋的IgE抗体与血样中特异性的IgE竞争抗原的酶联免疫反应、包埋的抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再与标记的抗原，或抗原与标记抗体的酶联免疫反应、抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再结合中药注射剂成分，采用GC/MS、HPLC/MS分析其指纹图谱差异来确定中药注射剂(拟)使用者血样中的特异IgE。总体方法是用针对动物实验的抗原抗体去套人或动物使用中药注射剂剂致敏所产生的特异性抗体IgE及成分。或采用HPLC/MS、GC/MS来分析特异性抗体IgE所作用的特异性成分，诸法联合确定中药注射剂剂致敏原。