[发明专利]基于适体-金纳米-酶复合物的凝血酶电化学传感器检测法

权利要求书

1.首先参考文献(Lyon，J.L.，Fleming，D.A.，Stone，M.B.，et al.Synthesis of Fe Oxide Core/Au Shell Nanoparticles by Iterative Hydroxylamine Seeding.Nano Letters，2004，4(4)：719-723)的方法合成金包磁性纳米粒子，然后将凝血酶适配体I捕获探针(此适配体I的序列为5′SH-(CH₂)₆-GGTTGG T GTGGTTGG)固定在金包磁性纳米粒子上。具体做法是：取50μL金包磁性纳米粒子悬浮液，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(pH 7.4，包含100mmol·L^-1氯化钠，5mmol·L^-1氯化钾，1mmol·L^-1氯化镁，5mmol·L^-1氯化钙)洗三次，再重新分散到495μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中超声30min。5μL巯基修饰的适配体I(100μmol·L^-1)加入到其中，室温下温和搅拌2h。磁性分离，再用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗三次，除去未反应的适配体I。然后将固定有适配体I的金包磁性纳米粒子分散到500μL 1mmol·L^-1的6-巯基己醇中封闭40min，磁性分离用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗三次后得到的纳米粒子分散到500μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，保存于4℃低温下。

2.首先参考文献(Storhoff，J.J.，Elghanian，R.，Mucic，R.C.，et al.One-Pot Colorimetric Differentiation of Polynucleotides with Single Base Imperfections Using Gold Nanoparticle Probes.Journal of the American Chemical Society，1998，120(9)：1959-1964.)的方法合成金纳米粒子，然后用该金纳米粒子进一步制备适配体-金纳米粒子-辣根过氧化物酶检测探针(此适配体II的序列为5′SH-(CH₂)₆-(T)₂₀AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGA CT)。具体做法是：首先，将5μL(100μmol·L^-1)带巯基的适配体II溶解于500μL的5倍浓度的金纳米粒子溶液中，4℃下静置24h，使适配体II中巯基与金纳米粒子充分自组装。然后，将适配体II探针标记的金纳米粒子溶液在12000转速离心分离20min，离心分离后弃去上层清液，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗涤沉淀并重新分散到三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，再离心分离，以除去未反应的过量适配体II，所制得的适配体II探针标记的金纳米粒子再次分散到1mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，向其中加入50μL辣根过氧化物酶(1mg·mL^-1)反应1h，再将混合物12000转离心分离15min，取出上层清液，红色沉淀用包含2％牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗涤，再离心分离，以除去未反应的辣根过氧化物酶，所得的适配体II-金纳米粒子-辣根过氧化物酶复合物分散到包含2％牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，保存于4℃低温下。

3.凝血酶传感器的构建：取30μL固定有适配体I的金包磁性纳米粒子悬浮液于离心管中，各加入50μL不同浓度的凝血酶溶液，再加入20μL适配体II-金纳米粒子-辣根过氧化物酶探针溶液，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液调整到200μL，在4℃下培育反应30min。凝血酶蛋白与适配体I和适配体II特异性结合形成[金包磁性纳米粒子-适配体I]/凝血酶/[适配体II-金纳米粒子-辣根过氧化物酶]三明治结构。然后，磁性分离沉淀，用200μL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液洗涤三次，以除去未与凝血酶结合的适配体II-金纳米粒子-辣根过氧化物酶探针，再分散到100μL含有2％牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中。

4.电化学检测：取30μL[金包磁性纳米粒子-适配体I]/凝血酶/[适配体II-金纳米粒子-辣根过氧化物酶]三明治结构的悬浮液滴到处理好的金电极表面，电极后面置放磁铁以将三明治结构的磁性复合物固定到金电极上，再将其插入到对苯二酚(2mmol·L^-1)和双氧水(1.5mmol·L^-1)的底物溶液中，插入参比电极和对电极。5min后采用差示脉冲伏安法扫描(电位范围：0.1V～-0.3V(vs.SCE)，振幅0.05V，脉冲宽度0.05s)。