[发明专利]基于适体-金纳米-酶复合物的凝血酶电化学传感器检测法

说明书

技术领域

本发明涉及基于适配体-金纳米粒子-辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的方法，属于分析化学领域。

背景技术

近年来，蛋白质的检测在疾病诊断、基础研究等诸多生物领域引起了广泛关注。在众多蛋白质检测中，传统的技术都是通过抗体来识别蛋白质的。然而，以适配体为识别元件的新型识别技术正在不断地发展研究中。适配体，是一类通过指数富集配基系统进技术筛选得到的具有3-D结构的特殊序列的寡聚核苷酸片段，可以是RNA，也可以是DNA。目前，用该技术所筛选出的适配体能特异性识别不同的目标物，主要包括：离子、有机小分子、缩氨酸、蛋白质以及完整的细胞等。与抗体相比，适配体具有化学稳定性好、易于化学修饰、高度亲和力和易储存等优点。基于适配体技术检测蛋白质的方法已经研究了很多，如比色法，荧光法，石英晶体微天平，化学发光，SPR，试剂条和电化学检测等。在这些技术中，电化学方法由于它的灵敏度高，仪器简单，成本低，响应快，可携带以及便宜等特点而备受关注。

临床检测中，病人体内的关键蛋白质的浓度往往很低，为实现蛋白质的超灵敏检测，发展新的具有信号放大作用的检测方法很有必要。目前，电化学适配体传感器中有很多基于标记的方法而使信号放大。(1)电活性物质直接标记在生物分子上作为电化学标签来放大电化学响应(如二茂铁、亚甲基蓝)。(2)纳米材料也可用作电活性物质标记来放大生物分子的检测信号(包括金属纳米粒子和半导体纳米晶等)。(3)酶作为电活性标记，通过酶的催化反应来放大信号。然而，在正常情况下，血液中不存在凝血酶，但当在血液凝固过程中凝血酶的浓度能达到低微摩尔，故在止血初期产生的低水平的凝血酶(低至纳摩尔)在整个过程中都起着非常重要的作用。而上述所介绍的蛋白质检测方法的灵敏度都还未达到纳摩尔和皮摩尔水平。因此，迫切需要满足生物分子电化学检测的高灵敏度的新方案。

目前，电活性和光活性分子标记的纳米粒子已成功用于提高生物分析的灵敏度，在这些纳米材料中，金纳米粒子由于具有极好的电子传递能力，大的比表面积以及对生物分子有强的吸附能力，同时具有良好的生物相容性，而受到广泛的关注。很多光或电活性分子如二茂铁、亚甲基蓝和酶能够固定在金纳米粒子上从而起到信号放大的作用。另外，磁性纳米粒子在生物分析领域也有广泛的应用。如金包Fe₃O₄磁性纳米粒子它既可以用作固相载体，体系分离，也可以富集样品，为构造灵敏的传感器提供了前景。另外，它可以通过外部的磁场被固定在电极表面，能够很大程度地简化分析过程。

发明内容

基于金纳米粒子具有大的比表面积、强的吸附能力和很好的生物相容性以及辣根过氧化物酶良好的催化性能，本发明提供了一种基于适配体-金纳米粒子-辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的方法。

本发明的目的是提供基于适配体-金纳米粒子-辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的方法。该方法可用于凝血酶的灵敏、特异性检测，从0.1nmol·L^-1到60pmol·L^-1浓度范围内对凝血酶检测呈现良好的线性响应，检测限为30fmol·L^-1。

图1为基于适配体-金纳米粒子-辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的示意图。从图1可知，适配体I固定在磁性纳米粒子上作为捕获探针，金纳米粒子作为载体负载大量的辣根过氧化物酶及固定适配体II(A)。当凝血酶存在时，两段适配体与凝血酶结合形成三明治结构复合物；通过磁性分离将得到的三明治结构复合物富集至电极表面，用差分脉冲伏安法检测电极表面辣根过氧化物酶的催化信号，可对凝血酶进行灵敏检测(B)。相反，当不存在凝血酶时，适配体-金纳米粒子-辣根过氧化物酶复合物就不会连接到磁性纳米粒子上，从而不能被分离，故不会产生电化学信号。这样，根据电化学信号实现对凝血酶的高灵敏检测。

利用电化学技术检测凝血酶的步骤如下：