[发明专利]成品烟烟丝总DNA的提取方法有效
申请号: | 201110172183.1 | 申请日: | 2011-06-24 |
公开(公告)号: | CN102286461A | 公开(公告)日: | 2011-12-21 |
发明(设计)人: | 李元实;马林;王春利;朴永革;金哲;崔成哲;于海顺 | 申请(专利权)人: | 吉林烟草工业有限责任公司;郑州轻工业学院 |
主分类号: | C12N15/10 | 分类号: | C12N15/10 |
代理公司: | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人: | 朱建新;逯长明 |
地址: | 133000 吉林省延*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 成品 烟丝 dna 提取 方法 | ||
技术领域
本发明涉及烟丝技术领域,尤其是成品烟烟丝总DNA的提取方法。
背景技术
在实际生产中,由于年景的不同,烟叶会受到气候等因素的影响,某些地区的烟叶质量会发生波动,造成卷烟质量也发生波动。卷烟企业就会根据烟叶变化情况对叶组配方进行调整,即进行烟叶临时替代。在烟叶临时替代过程中,烟叶品种的变化对卷烟感官品质有重要影响。通过提取得到卷烟烟丝中DNA,建立卷烟产品的DNA指纹数据库,将卷烟配方DNA指纹图谱与卷烟感官评吸相结合,能对卷烟市场产品质量监督检查提供更科学的依据,如通过对卷烟烟丝DNA的分析,能从根本上鉴别出卷烟的真伪;卷烟作为一种转基因的模式植物,为杜绝进出口卷烟中的转基因成分,对卷烟进行出口前检测是必不可少的工作环节。
因此,研究一种简单、快速的卷烟烟丝中DNA的提取方法对卷烟质量的监控、卷烟真伪鉴别和卷烟转基因检测都有重要意义。然而卷烟是一种深加工食品,而加工程度越深,DNA的提取难度就越大。成品卷烟烟丝已经不能提取得到完整的基因组DNA。因为成品烟丝与新鲜烟叶的不同在于其经过初烤、复烤、切丝、烘丝等工序中的高温、高压、高湿、机械加工剪切以及加香加料后制成烟丝,不但增加了DNA提取过程中的污染物,还使基因组DNA严重降解,成为小于1000bp的小片段。由于烟草植物中次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解,而多糖的污染也是影响烟草DNA纯度最常见的问题。
朱生伟等利用改良后SDS法提取得到新鲜烟叶中可用烟草育种,较纯净、高产率、大分子量的基因组DNA。
寇姝燕等通过对比研究表明二次选择法得到的高分子量DNA总量更高,同时二次选择法得到的纯度更高,可以用于制备烟草BAC文库。
任如意等以改良CTAB法提取复烤烟叶DNA,经U-3000紫外分光光度计测定,所获DNA呈典型的吸收曲线,且OD260/OD280在1.7~1.9之间;对烟草叶绿体不编码序列进行PCR扩增,获得理想条带。
国际烟草科学研究中心介绍了提取新鲜烟叶基因组DNA的碱裂解法、改良后的CTAB法和酚/氯仿抽提法,同时指出,烟丝DNA的提取还需进一步研究。
国内外关于烟草DNA的提取技术研究都是基于新鲜烟叶或者复烤烟叶,而对成品卷烟烟丝的DNA提取技术研究,国内外鲜见相关文献报道。
发明内容
本发明针对不足,提出一种成品烟烟丝总DNA的提取方法,减少成品烟烟丝中的杂质,提高烟丝总DNA的提取效率,便于后续的成品烟品牌鉴定和转基因检测等。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:一种成品烟烟丝总DNA的提取方法,包括以下步骤:
①、用65%~80%的乙醇水溶液浸泡成品烟烟丝,室温下7~9小时;过滤取滤液,40℃~50℃烘干;
②、向步骤①烘干产品中加入2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液,充分混匀,于60℃~70℃保温20~40min;
③、步骤②反应产物降温至室温,加入与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液,混匀后离心,取上清液;
④、步骤③上清液中加入用量与步骤②提取缓冲液相同体积的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液,以及用量与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液,混匀;离心,取上清液;
⑤、向步骤④上清液中加入1~2倍体积的十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液,混匀,静置;离心,得沉淀物;
⑥、向步骤⑤的沉淀物中加入1.2~1.5mol/L NaCl溶液,搅拌溶解;离心取上清液;
⑦、向步骤⑥得到的上清液中加入2~4倍体积经-20℃~-30℃预冷的无水乙醇,混匀,静置;离心,得沉淀物。
优选的,步骤③、④、⑤、⑥或⑦中离心的条件为12000~15000r/min,10~15min。
优选的,所述步骤②或④中2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液由下述组分构成:
优选的,所述步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液由下述组分构成:
优选的,步骤②中的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液为在65℃预热过的。
优选的,步骤①中用的乙醇水溶液为70%。
优选的,步骤①中浸泡时间为8小时。
优选的,步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液的用量为上清液体积的2倍。
优选的,步骤⑤中静置为0.8~2小时。
优选的,步骤⑦中静置为20℃下静置30min。
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