[发明专利]成品烟烟丝总DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及烟丝技术领域，尤其是成品烟烟丝总DNA的提取方法。

背景技术

在实际生产中，由于年景的不同，烟叶会受到气候等因素的影响，某些地区的烟叶质量会发生波动，造成卷烟质量也发生波动。卷烟企业就会根据烟叶变化情况对叶组配方进行调整，即进行烟叶临时替代。在烟叶临时替代过程中，烟叶品种的变化对卷烟感官品质有重要影响。通过提取得到卷烟烟丝中DNA，建立卷烟产品的DNA指纹数据库，将卷烟配方DNA指纹图谱与卷烟感官评吸相结合，能对卷烟市场产品质量监督检查提供更科学的依据，如通过对卷烟烟丝DNA的分析，能从根本上鉴别出卷烟的真伪；卷烟作为一种转基因的模式植物，为杜绝进出口卷烟中的转基因成分，对卷烟进行出口前检测是必不可少的工作环节。

因此，研究一种简单、快速的卷烟烟丝中DNA的提取方法对卷烟质量的监控、卷烟真伪鉴别和卷烟转基因检测都有重要意义。然而卷烟是一种深加工食品，而加工程度越深，DNA的提取难度就越大。成品卷烟烟丝已经不能提取得到完整的基因组DNA。因为成品烟丝与新鲜烟叶的不同在于其经过初烤、复烤、切丝、烘丝等工序中的高温、高压、高湿、机械加工剪切以及加香加料后制成烟丝，不但增加了DNA提取过程中的污染物，还使基因组DNA严重降解，成为小于1000bp的小片段。由于烟草植物中次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响烟草DNA纯度最常见的问题。

朱生伟等利用改良后SDS法提取得到新鲜烟叶中可用烟草育种，较纯净、高产率、大分子量的基因组DNA。

寇姝燕等通过对比研究表明二次选择法得到的高分子量DNA总量更高，同时二次选择法得到的纯度更高，可以用于制备烟草BAC文库。

任如意等以改良CTAB法提取复烤烟叶DNA，经U-3000紫外分光光度计测定，所获DNA呈典型的吸收曲线，且OD260/OD280在1.7～1.9之间；对烟草叶绿体不编码序列进行PCR扩增，获得理想条带。

国际烟草科学研究中心介绍了提取新鲜烟叶基因组DNA的碱裂解法、改良后的CTAB法和酚/氯仿抽提法，同时指出，烟丝DNA的提取还需进一步研究。

国内外关于烟草DNA的提取技术研究都是基于新鲜烟叶或者复烤烟叶，而对成品卷烟烟丝的DNA提取技术研究，国内外鲜见相关文献报道。

发明内容

本发明针对不足，提出一种成品烟烟丝总DNA的提取方法，减少成品烟烟丝中的杂质，提高烟丝总DNA的提取效率，便于后续的成品烟品牌鉴定和转基因检测等。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种成品烟烟丝总DNA的提取方法，包括以下步骤：

①、用65％～80％的乙醇水溶液浸泡成品烟烟丝，室温下7～9小时；过滤取滤液，40℃～50℃烘干；

②、向步骤①烘干产品中加入2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液，充分混匀，于60℃～70℃保温20～40min；

③、步骤②反应产物降温至室温，加入与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀后离心，取上清液；

④、步骤③上清液中加入用量与步骤②提取缓冲液相同体积的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液，以及用量与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀；离心，取上清液；

⑤、向步骤④上清液中加入1～2倍体积的十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液，混匀，静置；离心，得沉淀物；

⑥、向步骤⑤的沉淀物中加入1.2～1.5mol/L NaCl溶液，搅拌溶解；离心取上清液；

⑦、向步骤⑥得到的上清液中加入2～4倍体积经-20℃～-30℃预冷的无水乙醇，混匀，静置；离心，得沉淀物。

优选的，步骤③、④、⑤、⑥或⑦中离心的条件为12000～15000r/min，10～15min。

优选的，所述步骤②或④中2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液由下述组分构成：

优选的，所述步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液由下述组分构成：

优选的，步骤②中的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液为在65℃预热过的。

优选的，步骤①中用的乙醇水溶液为70％。

优选的，步骤①中浸泡时间为8小时。

优选的，步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液的用量为上清液体积的2倍。

优选的，步骤⑤中静置为0.8～2小时。

优选的，步骤⑦中静置为20℃下静置30min。