[发明专利]对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及对虾传染性病毒的检测试剂盒及检测方法，属于海洋生物病原检测技术领域。

背景技术

传染性肌肉坏死病为2002年在巴西发现的一种危害对虾生产的新的病毒性传染病，2004年美国亚利桑纳大学Donald V.Lightner博士研究发现该病由一种新的病毒引起并将之定名为传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，简称IMNV)。这种新型病毒为双链RNA病毒，属于整体病毒科。对虾传染性肌肉坏死病毒的易感对虾种类为南美白对虾，主要是感染60-80天的幼虾。该病毒能造成感病对虾全身肌肉组织坏死，一般情况下，病理死亡发生缓慢，死亡率不高，但整个养殖过程都有死亡，累积死亡率可达70％。

目前已有的传染性肌肉坏死病毒RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)检测方法为套式RT-PCR检测方法，检测过程较为繁琐、费时。而进行对虾传染性肌肉坏死病毒早期检测并采取预防措施是对虾养殖中降低对虾传染性肌肉坏死病毒流行风险、减少对虾发病导致经济损失的有效手段，所以建立简单快速高灵敏的检测方法，以及配合该检测方法使用的病毒检测试剂盒极为重要。

发明内容

本发明的目的在于解决现有套式RT-PCR检测方法中存在的检测过程繁琐费时的问题，提供对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，同时还提供了利用该试剂盒进行检测的检测方法，该检测方法灵敏、特异，且可缩短反应时间，减少实验步骤。

本发明是通过以下技术方案实现的：

对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，其特殊之处在于包括：

(1)、RT-PCR buffer管，内装2×RT-PCR buffer；

(2)、引物管，内装传染性肌肉坏死病毒正反引物；

(3)、酶管，内装反转录酶及DNA聚合酶；

(4)、去离子水管，内装无菌去离子水；

(5)、阴性对照管，内装SPF(无特定病原体)对虾核酸；

(6)、阳性对照管，内装传染性肌肉坏死病毒cDNA阳性克隆。

所述RT-PCR引物对包括

正向引物序列5’-CCAACATACGGTACAGTGGCAG-3’

反向引物序列5’-ATCGGTTGCCCAGGATACAAG-3’

产物长度为123bp。

对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测方法如下

(1)RT-PCR反应体系：

(2)RT-PCR反应程序：

cDNA合成和预变性：45℃30min，94℃2min，1个循环；

PCR扩增：94℃变性15s，55℃退火30s，72℃cDNA合成1min，40个循环；

终延伸：72℃延伸5min，1个循环；

4℃保存。

本发明对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒，根据传染性肌肉坏死病毒的全基因序列重新设计引物，经一步法RT-PCR检测传染性肌肉坏死病毒，此试剂盒可应用于对虾健康苗种培育、养殖防病、病毒生态调查、虾苗放流等过程的传染性肌肉坏死病毒检测，具有很高的推广应用价值。该方法灵敏、特异，且可缩短反应时间，减少实验步骤。

附图说明

图1：对虾传染性肌肉坏死病毒的灵敏度检测示意图；

M Marker；1-9 10⁸-1拷贝经10倍梯度稀释的传染性肌肉坏病毒cDNA克隆；N空白对照。

图2：对虾传染性肌肉坏死病毒的特异性检测示意图；

M Marker；1传染性肌肉坏病毒；2肝胰腺细小病毒；3斑节对虾杆状病毒；4传染性皮下及造血组织坏死病毒；5白斑综合征病毒；6桃拉综合征病毒；7黄头病毒；8 SPF对虾DNA；9水；10空白对照。

具体实施方式

以下参照附图，给出本发明的具体实施方式，用来对本发明的构成进行进一步说明。

实施例1

本实施例对虾传染性肌肉坏死病毒一步法RT-PCR检测试剂盒及检测方法

引物：根据GenBank中的IMNV全基因序列(AY570982)，设计了RT-PCR引物，正向引物序列5’-CCAACATACGGTACAGTGGCAG-3’，反向引物序列5’-ATCGGTTGCCCAGGATACAAG-3’，产物长度为123bp。

RT-PCR反应体系：

RT-PCR反应程序：