[发明专利]miRNA吸收载体、其制备及用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种新型miRNA吸收载体的构建方法及其应用。 

背景技术

MicroRNA(miRNA)是长约20～24nt、非编码的微小RNA，通过其种子区域与靶基因mRNA 3’UTR区部分互补从而介导30％左右的哺乳动物基因的转录后调控(Lewis，B.P.等，Cell.2005，120：15-20)。 

MiRNA参与了诸多生命过程关键步骤的调控，包括特定组织或细胞的分化、凋亡、增殖和维持。此外，miRNA表达水平失调与肿瘤等疾病也密切相关【Lu，J.等，Nature.2005，435：834-838；Li，Q.J.等，Cell.2007，129：147-161；Cheng，H.Y.等，Neuron.2007，54：813-829；Chang，T.C.等，Mol Cell.2007，26：745-752；He，L.等，Nature.2005，435：828-833；Care，A.等，Nat Med.2007，13：613-618】。 

但迄今为止，在培养细胞和动物模型中，已被实验证实的miRNA-mRNA相互作用的例子还相对较少，大多数miRNA的功能也尚未明确。鉴于miRNA行使其功能时，其生理性的浓度至关重要，故外源性地高表达某个miRNA时，会导致其浓度过高而容易出现某些实验假象。因此，确定某个miRNA功能的最好方式是敲减或者敲除这个目的miRNA。但是，由于单个miRNA可能由基因组上多个位置的基因转录而来，且同一家族的miRNA具有相同的种子序列从而功能上是互补的，所以用传统基因敲除的方法制备miRNA敲除模型非常困难。找到一种能在体、内外抑制一组功能类似的miRNA的方法受到普遍的关注。 

目前，化学修饰的反义寡核苷酸是沉默内源性miRNA功能的主要策略，这些寡核苷酸一般被2’甲氧基修饰(核糖核酸的2位羟基被甲氧基取代)、LNA修饰(核糖核酸五碳环上的羟基被桥联形成锁核酸)或肽核酸修饰(假肽骨架取代糖骨架)。为增强寡核苷酸进入特定组织或细胞的能力，也可以在寡核苷酸链的3’ 羟基末端接上吗啡啉或者胆固醇【Medina，P.P.和Slack，F.J.，Nat Methods2009，6：37-38】。这些寡核苷酸通过与miRNA成熟体互补而降解或者扣押之，从而抑制miRNA的功能。通过基因转移手段，转移足够量的寡核苷酸进入细胞，可以中和胞浆内所有的miRNA，从而可达到类似于基因敲除类似的效果。 

前面的研究已经证实，通过强启动子可高表达miRNA的靶，如果这些人为的靶达到足够的浓度，其功能也可以类似于miRNA的抑制剂，甚至强于已有的商业化的抑制剂【Ebert，M.S.等，Nat Method.2007，4：721-726；Ebert，M.S.和Sharp，P.A.，RNA.2010，16：2043-2050；Gentner，B.，G.等，Nat Methods.2009，6：63-66；Haraguchi，T.等，Nucleic Acids Res.2009，37：e43】。 

为了增强这些诱饵靶对目的miRNA的亲和力，多个miRNA的结合位点被插入到靶的3’UTR区。通过设计带有膨起的miRNA结合靶序列(一般是在Argobaute 2剪切的位点设计膨起序列)，这些靶序列能够稳定地结合或吸收带有目的miRNA的微核糖核蛋白复合体。这些靶RNA的序列可以瞬时地从转染的质粒或者稳定插入染色体的序列表达而来。由于诱饵mRNA与miRNA的结合主要靠miRNA 2～8位的种子序列碱基互补配对，所以一个诱饵mRNA可以与同一种子序列的所有miRNA结合(一般同一家族的miRNA具有相同的种子序列)。 

诱饵靶mRNA，也被称为miRNA吸收序列，相对于商业化的miRNA寡核苷酸抑制剂，它具有以下优点：首先，它可以制成miRNA吸收载体，从而具有载体共有的优势，比如，可以制备成病毒载体而转染难以转染的细胞，甚至在体内高表达该载体；可以用于制备稳转细胞系或者转基因动物模型；可以通过更换细胞特异性的启动子而使其特异性表达；其次，由于它可以同时吸收同一家族的miNRA，故比只能吸收完全互补的某一个miRNA的寡核苷酸抑制剂更加强大，更能避免miRNA的功能冗余现象；并且，吸收载体较化学修饰的miRNA而言价格相对低廉、且稳定性强。