[发明专利]一种浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法。

背景技术：

浮游动物是食物链的次级生产者，在海洋食物网中处于承上启下的枢纽位置，是海洋生物泵的主要驱动者，对生源要素的生物地球化学循环作用显著。因此，开展其摄食生态学研究对了解海洋生态系统的结构功能，量化物质和能量沿食物链的级联效应，探讨海域生物生产力水平及其变化规律具有重要意义。运用分子生物学技术，可突破“培养”环节，直接研究自然环境中浮游动物的肠道食物组成及其摄食效率，明确其相应功能反应，准确构建现场浮游食物网的定性结构，进而解析区域生态系统的功能和效率。这些研究都要以获取高质量浮游动物肠道内含物基因组DNA为前提。但是由于浮游动物体表常附着有其他生物，因此要准确获得浮游动物摄食状况，首先要保证其体表无其他生物污染；要获取高质量的肠道DNA样品，必须保证浮游动物组织破碎完全，并且还许保证DNA裂解液能够完全裂解浮游动物的组织及其肠道内含物，从而获得高质量的DNA。

CTAB是一种阳离子去污剂，具有沉淀核酸的特性；SDS使细胞裂解，使与DNA双链紧密相连的组蛋白分开和变性；EDTA螯合Mg²⁺或Mn²⁺离子，可抑制核酸酶的活性；蛋白酶K水解蛋白质，在SDS中稳定，不受EDTA的抑制，反应温度一般为50-55℃，可以用于消化各种蛋白；Tri-HCl提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；NaCl提供一个高盐环境，使核酸充分溶解，存在于液相中。氯仿去除变性的蛋白质及多糖、脂类等杂质。

目前，尚无浮游动物及肠道内含物总基因组DNA提取方法的专利报告。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能从浮游动物中提取浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA，并能最大限度的减少浮游动物的肠道内含物DNA量的损耗的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法。

本发明的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

(a)将浮游动物用中性鲁格氏液固定，再将同一种类的固定好的浮游动物分在一起，然后将固定好的同一种类的浮游动物用无菌、且经过0.2μm滤膜过滤的海水反复冲洗浮游动物的体表，直至体表无其他生物附着；取出浮游动物，再用无菌超纯水清洗，取出将水吸干，冰冻成块，再研磨破碎；

(b)将研磨破碎的浮游动物用DNA裂解液裂解，55℃裂解2～48h，然后用常规方法提取裂解后溶液中的DNA，所得到的DNA即为浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA；

所述的DNA裂解液为Tris-HCl 10～50mM，SDS 5～10g/L，EDTA 100mM，蛋白酶K 200～500μg/mL，其余为水，pH8.0。

提取得到的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA可以通过紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，确保后续使用的是高质量的DNA。

所述的步骤(a)中的将浮游动物冰冻成块，优选用液氮或低温将其冰冻成块，更优选用用-80℃的超低温冰冻，因为1.5ml离心管用液氮冷冻的话，操作起来不方便，而且为了减少工作人员的危险性，优先选用-80冷冻。

所述的步骤(b)将研磨破碎的浮游动物用DNA裂解液裂解，优选在55℃裂解48h，所述的DNA裂解液为Tris-HCl 10mM，SDS 5g/L，EDTA 100mM，蛋白酶K 200μg/mL，其余为水，pH8.0。该裂解液不但在此裂解条件下能够很好的裂解浮游动物组织及其肠道内含物，而且其用量少，并且不需要NaCl，因此比较经济。

本发明的中性鲁格氏液属于现有技术中的物品，其按照以下方法制备的：每100ml的中性鲁格氏液的配方：碘5g，碘化钾10g和超纯水100ml。分别称取碘5g与碘化钾10g，加入80ml超纯水中，搅拌溶解后，定容至100ml。

本发明将浮游动物用中性鲁格氏液固定，可以使浮游动物的肠道内含物不会排空和损失，从而保护肠道内含物受到最小量的损耗，为提取浮游动物及其肠道内含物的总基因组DNA奠定了基础，从而能真实的反应浮游动物的肠道内含物的状况。中性鲁格氏液能够很好的固定浮游动物及其肠道内含物并且不会对后续的DNA提取造成影响，而本发明人用甲醛固定浮游动物后再提取DNA，结果发现，DNA提取失败。