[发明专利]干扰Bx-cpl-2基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治和研究中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物病虫防治技术领域，特别是涉及一种干扰Bx-cpl-1基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治中的应用。

背景技术

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilu)是一种对森林具有极大危害的寄生线虫，它主要危害松属树种为代表的针叶树木。二十世纪，日本的松树感染上松材线虫后，遭到了毁灭性的破坏。在我国，松材线虫病于1982年在南京首次被发现。之后，疫情迅速蔓延，对我国的松林资源照成了极大的破坏，其经济损失难以估量，松材线虫病甚至已经直接对我国的张家界等世界自然文化遗产景观造成了威胁。

松材线虫病素有“松树的癌症”之称，因为其蔓延异常迅速，一旦发病，树木会很快死亡，因而防治难度非常之大。由于该病疫的传播和人类的活动有密切的关系，因此不少国家将其列为A类植物检疫对象。为了避免松材线虫病对我国的森林资源照成危害，对于松材线虫病的防治迫在眉睫。

松材线虫病的传播异常迅速，一旦疫情发生就难以控制。该病到目前为止仍然没有得到有效的控制。因此，要始终坚持以预防为主的政策，对于已经受灾的地区要严格控制松材线虫的蔓延。

目前，主要可以通过两种方法治疗松材线虫病。由于松材线虫在树干内部，因此可以将杀虫剂注射到树干或浇灌到根部，另一种是用飞机喷撒化学药剂来防治天牛。这两种方法有一定疗效，但是其性价比较低。对于树干注射治疗，其成本高，因此不适合大面积推广；而用飞机喷撒化学药剂来防治天牛，成本也比较昂贵，并且具有一定负面效应。

由于化学防治具有较多缺陷，因此人们开始更多地关注松材线虫的生物防治。研究显示：许多真菌对线虫的生存有抑制作用，如总状共头霉和日本亮耳菌等，但是由于松材线虫的繁殖速度惊人，生物防治的作用远远赶不上其扩散速度。

因此，已有的防治措施都无法有效防治松材线虫。我们只能寄希望于致病机理研究上的突破。目前，最经济有效的途径是利用分子生物学技术，对松树的抗性基因进行筛选，然后再通过转基因技术使松树获得对松材线虫的抗性。

半胱氨酸蛋白酶的活性位点含有半胱氨酸残基。该酶广泛存在于自然界的各种生物当中，例如细菌、真菌、植物、哺乳动物和人类等。因此，关于该酶的研究比较多。研究表明，半胱氨酸蛋白酶在线虫入侵组织或细胞、提供胚胎发育所需的营养成分^[12]、蜕皮^[13]、消化宿主蛋白、调节免疫反应以及逃避宿主免疫反应的清除^[14]等过程中发挥着至关重要的作用。

半胱氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶的一类。该酶在生物体内最开始合成时为一种前体物质，该物质包括两个区：前体区和催化区。半胱氨酸蛋白酶家族中有高度保守的典型的三联体催化活性中心Cys-His-Asn^[15]。线虫半胱氨酸蛋白酶为线虫的主要“消化酶”，通常表达在线虫的食道腺和肠细胞中，发挥着蛋白水解活性。线虫摄取食物、入侵宿主细胞以及免疫等方面的功能均与半胱氨酸蛋白酶有密切关系，因此，近年来对该酶的研究愈加广泛深入。

研究发现，半胱氨酸蛋白酶存在于多种线虫体内，不同的线虫，分泌这种酶的部位不同，而且酶的分布部位也有所差异。有些线虫的卵母细胞中包含L型半胱氨酸蛋白酶，如秀丽隐杆线虫；在很多线虫的不同发育期，虫体肠腔内中都发现了B型和L型半胱氨酸蛋白酶，如捻转血矛线虫(Haemonchus controtus)和南方根结线虫(Meloidyne incognita)。

吕春花(吕春花.相似穿孔线虫S型半胱氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析[J].植物保护，2008，34(5)：17-22.)等从松材线虫中分离到半胱氨酸蛋白酶家族的两个基因(Bx-cpl-1、Bx-cpl-2)并在大肠杆菌中初步表达，但并未揭示并证明这两个基因在线虫生活史中的功能。