[发明专利]一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法

权利要求书

1.一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)培养基的制备

液体种子活化培养基：用葡萄糖5g，NaCl5g，牛肉膏5g和蛋白胨10g，水定容至1000ml，在121℃下灭菌30分钟后制得pH值为6.8～7.2的液体种子活化培养基，

摇瓶扩大培养基：用葡萄糖50g，(NH₄)₂SO₄ 20g，玉米浆15g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄0.5g，轻质CaCO₃ 6g，水定容至1000ml，在121℃下灭菌30分钟后制得pH值为6.8～7.2的摇瓶扩大培养基，

发酵转化培养液：用葡萄糖120～150g，(NH₄)₂SO₄ 20g，玉米浆15～20g，KH₂PO₄1g，MgSO₄ 0.5g，轻质CaCO₃ 6g，水定容至1000ml，在112℃下灭菌30分钟后制得pH值为6.8～7.2的发酵转化培养液；

2)菌种活化：将经冻干保藏的黄色短杆菌用5ml无菌生理盐水制成10⁸个/ml～10⁹个/ml的菌悬液后，接入液体种子活化培养基中在30℃～31℃下培养20～24小时后制得活化后的菌种；

3)菌种扩大培养与菌体细胞的收集：将步骤2)制得的菌种接种到摇瓶扩大培养基中，摇瓶扩大培养基的装液量为50～100mL/250mL三角瓶，菌种接种量为5％～10％，于30℃～31℃、转速150～200转/分的恒温振荡培养器中振荡培养22～24小时，然后将发酵液离心收集菌体细胞；

4)菌体细胞固定化：将步骤3)中收集的菌体细胞按1∶10～1∶5的比例和包埋剂混合均匀，滴入成型剂中固化成型后制得固定化菌体细胞；

5)L-异亮氨酸的转化：将步骤4)中制得的固定化菌体细胞装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，转化成L-异亮氨酸，收集流出的转化液；

6)L-异亮氨酸的分离纯化：将步骤5)中收集的转化液用活性炭脱色去除杂质后，减压浓缩至原来体积的30％～40％，于10℃～15℃下静置3～5小时育晶，即制得L-异亮氨酸结晶粗品。

2.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，其特征在于：步骤4)中的包埋剂为浓度为1～5％的海藻酸钠溶液。

3.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，其征在于：步骤4)中的成型剂为浓度为1～5％的氯化钙溶液，固化时间为2～3小时，固化温度为30℃～40℃。

4.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，其特征在于：步骤5)中的发酵转化培养液流经凝胶柱的流速为400～800mL/小时，生物转化温度为30～31℃。

5.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，其特征在于：步骤5)中收集到的转化液反复上柱，直到发酵转化培养液中的底物被完全转化成L-异亮氨酸。