[发明专利]一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞工程技术领域的氨基酸的制备方法，尤其是一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法。

背景技术

L-异亮氨酸属中性氨基酸，与L-缬氨酸、L-亮氨酸统称为支链氨基酸，作为氨基酸原料药中的一种，主要用于复合氨基酸输液、三支链氨基酸输液氨基酸口服液等，用于治疗肝病、肝昏迷，体弱乏力等疾病，是重要的氨基酸原料药之一，同时也广泛应用于食品及饲料等行业，其市场前景十分广阔。目前国内生产L-异亮氨酸均采用微生物发酵法，但普遍存在分离提纯不彻底、产品收率低和产品质量不稳定等方面的问题。而有关固定化细胞酶法制备L-异亮氨酸的方法未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，可以解决微生物发酵法的缺点，简化了工艺过程，提高了底物的利用率，底物L-异亮氨酸转化率高，产品得率高。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，该方法包括以下步骤：

1)培养基的制备

液体种子活化培养基：用葡萄糖5g，NaCl5g，牛肉膏5g和蛋白胨10g，水定容至1000ml，在121℃下灭菌30分钟后制得pH值为6.8～7.2的液体种子活化培养基，

摇瓶扩大培养基：用葡萄糖50g，(NH₄)₂SO₄ 20g，玉米浆15g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g，轻质CaCO₃ 6g，水定容至1000ml，在121℃下灭菌30分钟后制得pH值为6.8～7.2的摇瓶扩大培养基，

发酵转化培养液：用葡萄糖120～150g，(NH₄)₂SO₄ 20g，玉米浆15～20g，KH₂PO₄1g，MgSO₄ 0.5g，轻质CaCO₃ 6g，水定容至1000ml，在112℃下灭菌30分钟后制得pH值为6.8～7.2的发酵转化培养液；

2)菌种活化：将经冻干保藏的黄色短杆菌用5ml无菌生理盐水制成10⁸个/ml10⁹个/ml的菌悬液后，接入液体种子活化培养基中在30℃～31℃下培养20～24小后制得活化后的菌种；

3)菌种扩大培养与菌体细胞的收集：将步骤2)制得的菌种接种到摇瓶扩大培养基中，摇瓶扩大培养基的装液量为50～100mL/250mL三角瓶，菌种接种量为5％～10％，于30℃～31℃、转速150～200转/分的恒温振荡培养器中振荡培养22～24小时，然后将发酵液离心收集菌体细胞；

4)菌体细胞固定化：将步骤3)中收集的菌体细胞按1∶10～1∶5的比例和包埋剂混合均匀，滴入成型剂中固化成型后制得固定化菌体细胞；

5)L-异亮氨酸的转化：将步骤4)中制得的固定化菌体细胞装柱，将发酵转化培养液流经凝胶柱进行生物转化，转化成L-异亮氨酸，收集流出的转化液；

6)L-异亮氨酸的分离纯化：将步骤5)中收集的转化液用活性炭脱色去除杂质后，减压浓缩至原来体积的30％～40％，于10℃～15℃下静置3～5小时育晶，即制得L-异亮氨酸结晶粗品。

步骤4)中的包埋剂为浓度为1～5％的海藻酸钠溶液。

步骤4)中的成型剂为浓度为1～5％的氯化钙溶液，固化时间为2～3小时，固化温度为30℃～40℃。

步骤5)中的发酵转化培养液流经凝胶柱的流速为400～800mL/小时，生物转化温度为30～31℃。

步骤5)中收集到的转化液反复上柱，直到发酵转化培养液中的底物被完全转化成L-异亮氨酸。

本发明提供的一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，由于采用固定化细胞的方法，克服了目前生产L-异亮氨酸均采用的微生物发酵法存在分离提纯不彻底、产品收率低和产品质量不稳定等缺点，可以简便地收集转化液进行L-异亮氨酸的制备，使工艺过程得以简化，提高了底物的利用率，底物L-异亮氨酸转化率在90％以上，产品得率高于70％，且有利于工业化生产过程中的自动控制。

具体实施方式

实施例一

一种利用固定化细胞制备L-异亮氨酸的方法，该方法包括以下步骤：

1)培养基的制备