[发明专利]一种裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株

说明书

技术领域

本发明属于微生物遗传育种技术和发酵生物技术领域，尤其涉及用于生产DHA(二十二碳六烯酸，22:6，n-3)的诱变菌株。 

背景技术

DHA(Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸，22:6，n-3)是一种必需脂肪酸，即人体不能自生合成，又具有重要生理功能的长链脂肪酸。DHA是人的大脑和视网膜的主要组成成分，在大脑皮层中含量达20％，在视网膜中含量高达50％，因此，对胎婴儿的神经系统和视觉系统的发育起重要作用，是维持正常智力和视力的重要的保障，还具有防治心血管疾病、抗癌、抗炎等重要的生理功能。另外，DHA还是多种海水鱼类生长发育所需的必需脂肪酸，可以提高鱼苗的成活率和降低白化病发病率。传统上DHA从深海鱼油中获得，但从鱼油中提取的多不包含脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)存在着产量不稳、得率低、成本高及含有其它的ω-6PUFAs等问题，且随着渔业资源的日益紧张，传统的DHA资源已无法满足日益增长的市场需求。因此，开发DHA的新生资源已成为新的研究热点。 

裂殖壶菌(Schizochytrium sp)是一种已经开发为生产DHA和其他多饱和脂肪酸的商业资源海洋微藻或真菌样微生物，目前已被用来生产DHA。该菌使用安全，Hammond等人用其对白鼠、兔子进行了一系列的安全性检测，没有发现任何毒副作用。 

但是，在发酵生产的过程中，裂殖壶菌难免发生种质退化，从而导致DHA产率下降。因此，亟需改良该种质，从而提高生长率，尤其是提高DHA含量。 

乙酰辅A羧化酶[Acetyl-Co A carboxylase，ACC，(EC6.4.1.2)]是一种脂肪合成的关键酶，而除草剂喹禾灵{2-[4-(6-氯-2-喹恶啉氧基)-苯氧基] 丙酸乙酯}是该酶的抑制剂。在喹禾灵存在的情况下，细胞往往会因脂肪合成途径受阻变得生长缓慢甚至死亡。 

近年来，一些研究表明喹禾灵能够诱导微藻诱变，可以进一步筛选得到EPA含量提高的诱变株。 

例如，Chaturvedi等(2004)用MNNG对微绿球藻(Nannochloropsis oculata)诱变，再筛选抗除草剂喹禾灵藻株，EPA含量明显提高。 

Chaturvedi等(2006)用EMS对微绿球藻(Nannochloropsis oculata)进行诱变处理，再筛选浅蓝菌素(cerulenin)及红霉素(erythromycin)抗性藻株，EPA含量分别提高了29％和12％。 

Cao Xiaohong等(2007)先后用二甲基亚砜和喹禾灵处理硅藻菱形藻属(Nitzschia laevis)，其EPA的含量从3.00％提高到3.58％。 

已知裂殖壶菌不同于微绿球藻或硅藻菱形藻属，而且EPA的含量较低，到目前为止，还不清楚是否存在抗喹禾灵的诱变裂殖壶菌。而且如果存在这种突变株，也不清楚，经喹禾灵突变株筛选后是EPA的含量还是DHA的含量得到提高。尤其是，到目前为止，并不清楚，经UV诱变的裂殖壶菌是否能够在喹禾灵的筛选中活存。 

发明内容

本申请的发明人惊奇发现，用紫外诱变技术对裂殖壶菌实施诱变，然后利用关键脂肪合成酶(例如乙酰辅酶A羧化酶)抑制剂，例如但不限于喹禾灵，进行定向筛选，能够得到DHA含量增加的裂殖壶菌变异株。此外，根据以上获得的变异株DHA含量高，而且生长速度快。 

据此，第一方面，本发明提供生产具有增加的DHA含量的裂殖壶菌变异株的方法，包括(a)利用紫外线照射(UV)诱导裂殖壶菌突变，以及(b)将步骤(a)获得的菌株与乙酰辅酶A羧化酶的抑制剂接触，来筛选具有增加的DHA含量的裂殖壶菌突变株。 

在本发明的一个实施方案中，所述乙酰辅酶A羧化酶抑制剂是喹禾灵。在本发明的一个优选的实施方案中，所述DHA含量增加的变异株还具有快的生长速度，从而使得DHA的生产效率提高。 

在本发明的另一实施方案中，所述裂殖壶菌突变株的DHA含量的提 高是相对于其母体或起始菌株比较而言，优选地，该DHA含量高于经UV突变而未经乙酰辅酶A羧化酶抑制剂筛选的菌株。 

在第二方面，本发明提供裂殖壶菌的变异株，例如于2011年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏号为CCTCC M2011024的菌株裂殖壶菌2010-0321(Schizochytrium limacinum2010-0321)。