[发明专利]同时检测人EBV、BKV和 CMV的三重实时荧光定量PCR方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学分子生物检测技术。特别是一种可同时检测人EBV、BKV和CMV的三 重实时荧光定量PCR方法及试剂盒。可应用于移植后病人或其他免疫抑制状态下病人血清或 其他样品中三种病毒载量的同时监测。

技术背景

器官移植是现代医学的标志性学科之一。自1959年首例肾移植成功以来目前世界上已有 70多万尿毒症患者接受了器官移植而获得新生，而且这个数字还在以每年近5万的速度增加。 截至2003年，我国累计完成肾脏移植5万多例，现在每年完成超过5000例，数量仅次于美 国位居世界第二位。中国约有100多万尿毒症患者，每年还有近12万的新增病人。对这些患 者，肾脏移植是目前最重要的治疗手段。然而移植肾脏的长期存活，始终是肾移植成功与否 的主要问题。

感染是器官移植手术后重要的并发症之一，也是造成器官移植失败的重要原因。在移植 早期，感染造成的死亡率达40％-78％。随着新的免疫抑制药物的出现及其联合应用，使单一 药物用量有所下降，从而使感染引起的移植早期死亡率显著下降。尽管如此，在导致器官移 植受者死亡的原因中，感染仍居首位，其中病毒感染占很大的比例。移植后病毒感染早期可 能没有明显的临床表现，对移植肾的损伤也不易被发现，感染后期却会影响移植肾的功能。 同时，不同的病毒感染，往往需要不同的治疗方案才能奏效，因此，尽早诊断和预防病毒感 染，同时进行病毒载量与感染情况的不断监测，对降低肾移植后病毒感染的危害有很大的临 床意义。

巨细胞病毒(Cytomegalovirus CMV)，EB病毒，Epstein-Barr virus(EBV)以及BK病毒BK (polyomavirus BKV)是实体器官移植后最常见的病毒感染。即使在无症状的感染情况下，也 会对移植器官造成影响。目前已经有多种检测方法用于病毒滴度或载量的检测。最常用的为 免疫学方法和定量PCR方法。然而这些方法都只能同时检测一种病毒感染情况，病人要想了 解这三种病毒的感染情况，至少得做三个检测。最近有前瞻性研究表明，这三种病毒存在共 感染的情况，如果能有一种同时检测这三种病毒载量的方法，将会使检测过程变得方便、快 速。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，Real Time  PCR)以其快速、灵敏、特异、重复性好等特点前最常用病毒基因载量检测方法之一，广泛 的应用在各种病毒上。特别是Taqman探针技术，应用更加广泛。在移植相关病毒检测领域 目前已经有成熟的CMV，BKV，EBV病毒Taqman探针定量PCR检测试剂盒，均能够准确 迅速的检测病毒的载量。然而如前所述，这些检测试剂盒均只能检测一个靶标。

多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在同 一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于病毒诊断 检测领域。在移植后病毒检测方面，Kaoru Wada等用多重定量PCR技术，同时检测27例造 血干细胞病人和19例肝移植病人全血样品中的HHV-6病毒，CMV以及EBV病毒共计303 份样品，结果显示多重PCR体系与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。Yasuhito Funahashi等用多重定量PCR技术同时检测BKV病毒、JCV病毒以及腺病毒，同样取得良好 结果。这些结果都说明了多重PCR技术用于病毒检测可靠性。但是到目前为止，尚无报道有 同时检测CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时检测CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的多重定量 Taqman PCR方法，同时基于该方法提供相应的试剂盒。该试剂盒可用于人全血或尿液标本的 检测。

一种同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所 述实时荧光定量PCR的反应体系中同时采用以下三套引物及探针：

CMV-FP：ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，

CMV-RP：GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，

CMV-探针：CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1；

EBV-FP：GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，