[发明专利]鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

A鸭瘟病毒gG的DNA片段的获得

以鸭瘟病毒毒株基因组DNA为模板对gG基因进行PCR扩增，得鸭瘟病毒 gG基因片段，与pMD18-T 的连接，得pMD18-gG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其上游引物如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，下游引物如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

B 重组原核表达质粒pET32a-gG的获得

限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD18-gG质粒和原核表达载体pET32a(+),并连接, 得重组原核表达质粒pET32a-gG；

 C 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的获得 

将步骤B所得重组原核表达质粒pET32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，其特征在于：将步骤C所得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白进行亲和层析纯化，得纯化的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

3.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，其特征在于：将步骤B所得重组原核表达质粒pET32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度≥1.0mmol/L,诱导温度为25℃条件下进行诱导表达8-12小时，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

4.权利要求1-3任一项所述的制备方法所得的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白，其特征在于：所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.权利要求4所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗原中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获剂中的运用。

7.权利要求4所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。

8.运用权利要求4所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白稀释至终浓度为2.5μg/100μL，在酶标板中包被过夜，用封闭液封闭,得固相抗原；

B将待检血清作80倍体积稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将所述酶标二抗作2000倍体积稀释后，与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

E、将步骤d所述显色液用酶标仪测OD_450nm值，待检血清的OD_450nm值＞阴性样品OD_450nm值的临界值，即X+3SD时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品OD_450nm值的均值，SD为阴性样品OD_450nm值的标准方差。