[发明专利]鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

 本发明涉及基因工程，特别涉及检测鸭瘟病毒抗体的gG基因重组原核表达检测抗原蛋白以及它的制备方法。

背景技术

鸭瘟(Duck Plague, DP)，又名鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis, DVE)，是由鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV)引起鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、败血性传染病。鸭瘟的临床症状为精神沉郁、高热稽留、共济失调、下痢、畏光流泪和部分病鸭头颈肿大，该病为一种嗜全身性感染的传染病，以急性败血症为主要特征。其病理剖解特征是血管损伤，组织器官出血，消化道出血、炎症和坏死，消化道粘膜某些特定部位疹状损害，淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化。该病的流行特征是传播迅速、发病率和死亡率高，且对鸭、鹅和白天鹅易感，是水禽养殖业的一大危害。

过去对鸭瘟病毒血清抗体的检测方法主要是利用全病毒作为抗原进行检测，但传统的病毒分离鉴定方法大约需要4～5d，方法繁琐，费时费力，且纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，导致假阳性结果出现。

发明内容

发明的目的之一在于提供鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，该方法适用于大规模生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

A鸭瘟病毒gG的DNA片段的获得

以鸭瘟病毒毒株基因组DNA为模板对gG基因进行PCR扩增，得鸭瘟病毒 gG基因片段，与pMD18-T 的连接，得pMD18-gG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其上游引物如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，下游引物如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

B 重组原核表达质粒pET32a-gG的获得

限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD18-gG质粒和原核表达载体pET32a(+),以重组质粒为模板为模板，PCR扩增, 得重组原核表达质粒pET32a-gG；

 C 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的获得 

将步骤B所得重组原核表达质粒pET-32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

进一步，将步骤C所得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白进行亲和层析纯化，得纯化的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

 进一步，将步骤B所得重组原核表达质粒pET32a-gG转化至表达菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度≥1.0mmol/L,诱导温度为25℃条件下进行诱导表达，得鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白。

本发明的目的之二在于提供一种重组表达蛋白，该蛋白具有鸭瘟病毒免疫原性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白，所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的之三在于提供鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白的两种应用，其为鸭瘟病毒的检测和治疗提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案之一为：

所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗原中的应用。

进一步，所述鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获剂中的运用。

 本发明的另一技术方案为：

所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种鸭瘟病毒抗体的检测方法，该方法操作简单，无需价格昂贵的仪器。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

运用所述的鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体包括以下步骤：

A 鸭瘟病毒gG基因重组原核表达蛋白稀释至终浓度为2.5μg/100μL，在酶标板中包被过夜，用封闭液封闭,得固相抗原；

B将待检血清作80倍体积稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

C、将所述酶标二抗作2000倍体积稀释后，与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

D、在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；