[发明专利]鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及鸭瘟病毒抗体的试剂盒及检测方法。

背景技术

鸭瘟(Duck Plague,DP)是由疱疹病毒科中的鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、接触性传染的败血性传染病。该病可导致商品水禽产蛋量下降及死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的临床表现为精神沉郁，高热稽留，两腿麻痹、下痢、流泪，部分病鸭头颈肿大,是一种广泛嗜全身性感染的传染病，临床以急性败血症过程为特征；病理剖解特征是血管损伤，组织器官出血，消化道出血、炎症和坏死，消化道粘膜某些特定部位有疹状损害，淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化，其发病率和死亡率都甚高。近年来，随着养鸭业生产向集约化、规模化的方向发展，鸭瘟作为威胁养鸭业最严重的接触性传染病之一，造成了巨大的经济损失。

过去对鸭瘟病毒血清抗体的检测方法主要是利用全病毒作为抗原进行检测，但传统的病毒分离鉴定方法大约需要4～5天，方法繁琐，费时费力，且纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，导致假阳性结果出现。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白，该蛋白能作为鸭瘟病毒抗体的捕获剂。

为实现上述方案，本发明的技术方案为：

鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:2 所示。

本发明的目的之二在于提供鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的制备方法，该方法可用于鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白大规模生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

A、以DPV基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的上、下游引物PCR扩增得鸭瘟病毒 gG截段基因片段，与pMD18-T 的连接，得pMD18-gGM;

B、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD18-gGM质粒和原核表达载体pET32a(+),并连接, 得重组原核表达质粒pET32a-gGM;

C、并将上述提取的重组质粒pET32a-gGM转化到表达宿主菌诱导表达,得鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白粗品。

进一步，将步骤C所得鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白粗品经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后，得鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白；

进一步，步骤C中的宿主菌为菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度≥0.2mmol/L,诱导温度为30℃条件下进行诱导表达2小时，得鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白。

本发明的有益效果在于：鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白是选取鸭瘟病毒（DPV）gG基因编码蛋白的主要抗原域（68aa-377aa），并命名为gGM；然后利用基因工程技术，将其进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌BL21(DE3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是gGM/His融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为50kDa，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。经原核表达系统表达后的产品经Western blot进行鉴定后表面具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。

采用本发明的方法生产的产品可用于：

① 本产品可作为检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法的检测抗原。

② 可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。

本发明的产品优点体现在：

① 由于该检测抗原是鸭瘟病毒 gG截段重组蛋白，并非全病毒，以此应用该检测抗原进行检测时无散毒危险。

② 作为ELISA抗原检测鸭瘟病毒抗体，特异性强，无交叉反应。

③ 性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。

更多有益效果，将在实施例中体现。

图1为gG截段基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；其中1为gG截段基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带，M为DNA Marker。

    图2为重组质粒pMD18-gGM的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为DNA Marker，1为重组质粒pMD18-gGM 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。