[发明专利]用于去除所选择DNA序列的方法和手段

权利要求书

1.用于将植物基因组内的靶DNA序列交换成目的DNA序列的方法，包括如下步骤：

a.在植物细胞基因组内预先选择位点处诱导第一个双链DNA断裂，所述预先选择位点位于所述靶DNA序列内或位于所述靶DNA序列附近；

b.将目的DNA分子导入所述的植物细胞，所述的DNA分子包含：

i.位于两个侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，其中所述的侧翼DNA区域与所述植物细胞基因组内所述靶DNA序列的侧翼DNA区域并且优选所述预先选择位点的侧翼DNA区域具有至少80％序列同源性；

ii.位于所述侧翼DNA区域之间的选择标记基因或筛选标记基因，所述选择标记基因或筛选标记基因还位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的至少部分的所述侧翼DNA区域之一的另一拷贝之间，其中所述另一拷贝标示为部分侧翼DNA序列；

iii.位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的所述部分侧翼DNA区域之间的DSBI酶的识别位点；

c.选择包含所述选择标记或筛选标记的植物细胞的群体；

d.选择在其中所述选择标记或筛选标记已经借助所述侧翼DNA区域通过同源重组而导入的植物细胞并从所述植物细胞再生植物；

e.将包含所述选择标记基因的所述再生植物或其后代植物与包含编码DSBI酶的嵌合基因的植物杂交，所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段：

iv.小孢子特异性启动子；

v.编码可识别位于所述目的DNA内的所述识别位点的双链DNA断裂诱导酶的DNA区域；

vi.转录终止和聚腺苷酸化区域；

f.选择包含所述选择标记基因或筛选标记基因和编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物(F1植物)；

g.将所述的后代植物与另一植物杂交，由此使用所述后代植物作为花粉供体；

h.选择包含编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物的群体(F2群体)；和

i.选择如此的后代植物，在所述后代植物中所述的选择标记基因或筛选标记基因通过在所述侧翼DNA区域之一与包含所述侧翼DNA区域之一的一部分的部分侧翼DNA区域之间的同源重组被缺失。

2.权利要求1所述的方法，其中在所述预先选择位点处的所述第一个双链断裂通过导入第一个DSBI酶诱导，所述的第一个DSBI酶不识别位于所述目的DNA内的DSBI酶的所述识别位点。

3.权利要求2所述的方法，其中所述的第一个DSBI酶和识别位于所述目的DNA内的所述识别位点的所述DSBI酶是选自I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-MavI、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-MkaI、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-MxeI、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-MjaI、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I或包含Zn指DNA结合结构域和DNA切割结构域的嵌合内切核酸酶的两种不同DSBI酶。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中识别位于所述目的DNA内的DSBI酶的所述识别位点的所述DSBI酶是I-SceI。

5.权利要求4所述的方法，其中编码所述双链DNA断裂诱导酶的所述DNA区域包含SEQ ID No 1或SEQ ID No 2的核苷酸序列。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述小孢子特异性启动子包含选自SEQ ID No 3的核苷酸序列的启动子或其功能性片段。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中编码DSBI的所述嵌合基因包含SEQ ID No.6中从核苷酸1941至3913的核苷酸序列。

8.植物细胞，其通过权利要求1至7中任一项所述的方法可得到。

9.用于通过在所述靶序列内或在其附近的预先选择位点处诱导双链断裂而将植物细胞基因组内的靶DNA序列替换成目的DNA序列的DNA载体，所述DNA载体包含：

a.位于两个侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，其中所述的侧翼DNA区域与所述靶DNA序列的侧翼DNA区域和所述预先选择位点的侧翼DNA区域具有至少80％序列同源性；

b.位于所述侧翼DNA区域之间的选择标记基因或筛选标记基因，所述选择标记基因或筛选标记基因还位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的包含所述侧翼DNA区域之一的一部分的部分侧翼DNA区域之间；和

c.位于所述侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的所述部分侧翼DNA区域之间的DSBI酶的识别位点。