[发明专利]用于去除所选择DNA序列的方法和手段

说明书

本申请是中国专利申请200680011307.5的分案申请，原申请的申请日是2006年3月31日，发明名称是“用于去除所选择DNA序列的方法和手段”。

发明领域

本发明涉及在去除步骤期间不求助于体外(in vitro)培养，允许高效去除事先已导入所述植物内的目的DNA序列中所选择部分例如选择标记基因或筛选标记基因的方法和手段。去除方法可以作为用于在植物细胞和植物中将靶DNA序列经同源重组精确交换为目的DNA序列的方法的一部分使用，由此随后可以去除同源重组阶段期间为临时选择基因替换事件所用的选择标记或筛选标记，而不会留下痕迹并且在去除步骤期间不求助于体外培养。

技术背景

去除导入植物细胞或植物内，但在导入后随即因多种原因变成无用或甚至是多余的外源DNA中所选择亚片段已经是热点研究的主题。此类序列的实例例如是需要用于分离转基因植物而在成熟植物内不再需要的选择标记基因。实现高效消除选择标记基因的方法主要依赖位点特异性重组或转座(见例如Hohn等，Plant BioTechnology第139-143页)。

Siebert和Puchta(2002)描述可以通过同源重组和通过非同源末端连接从高等真核生物的基因组内高效地切除侧翼为切点罕见限制酶位点的转基因序列。

WO03/004659涉及重组系统并涉及用于从真核生物的染色体DNA中去除核酸序列的方法。该文件还涉及含有所述系统或通过该方法产生的转基因生物(优选地是植物)。

然而该方法基本上需要利用体外培养方法来鉴定或选择其中待去除DNA序列的缺失已经有效发生的那些植物细胞并从此类细胞再生植物。

美国专利申请2005/0060769提出从第一个转基因玉米(Zea mays)植物细胞中制备重组的转基因玉米植物或植物细胞的方法，其中相对于第一个转基因植物细胞内的转基因的遗传结构，重组植物或植物细胞内的转基因由于同源重组介导性转基因缺失作用而具有改变的遗传结构。

在下文，包括在权利要求书内，描述如此方法和手段的不同实施方案，该方法和手段可不求助于体外培养方法，高效去除已事先导入植物细胞内的DNA分子的部分中所选择的亚序列。

WO97/30166或美国专利6,407,314描述可以用于在小孢子内表达基因的来自烟草的小孢子特异性基因的启动子片段。

由本发明解决的另一个问题涉及定向和精确地将植物细胞内的靶DNA序列通过同源重组交换成替换性DNA序列，而不留下方法的痕迹，并且在同源重组的初始步骤后不求助于体外培养方法。为此目的，可以方便地施用如此方法，即其可以经染色体内同源重组而高效地去除事先已插入基因组、优选地是植物细胞的核基因组内DNA分子的部分中所选择亚序列。

早已认识到需要对植物内转基因整合的位点进行控制，并且已经开发数种方法试图满足这种需要(综述见Kumar和Fladung，2001，Trends in Plant Science，6，pp155-159)。这些方法基本上依赖于以同源重组为基础的转基因整合，该策略已经成功地应用于原核生物和低等真核生物(见例如EP0317509或相应的出版物Paszkowski等，1988，EMBO J.，7，第4021-4026页)。然而对于植物，用于转基因整合的主导机制以很少涉及重组DNA链间同源性的异常重组为基础。因而，此领域内的主要挑战是检测由所导入外源DNA经异常重组的极高效整合所掩盖的稀有同源重组事件。

解决此问题的一种方式是选择通过异常重组发生的整合事件，如WO94/17176内举例。

解决此问题的另一种方式是通过切点罕见内切核酸酶如I-SceI诱导双链DNA断裂而激活靶基因座。已经使用农杆菌(Agrobacteria)送递修复性DNA至植物细胞证实这种技术增加同源重组频率至少2个数量级(Puchta 等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，第5055-5060页)。

WO96/14408描述编码I-SceI酶的分离的DNA。该DNA序列可以并入克隆载体及表达载体、转化的细胞系和转基因动物。该载体用于基因作图和基因的位点定向性插入。

WO00/46386描述通过I-SceI双链断裂而修饰、修复、减弱和失活细胞内的基因或其它染色体DNA的方法。还公开了治疗或预防有需要的个体内遗传疾病的方法。还公开了嵌合的限制性内切核酸酶。