[发明专利]一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法

权利要求书

1.一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法，其特征在于包含以下步骤：

a)以某固态法白酒厂窖池发酵不同天数的酒醅为样品，取样后分别放置无菌离心管中，-20℃保存；

b)取0.5～2.0g酒醅样品加2.0～6.0mL 1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L NaH₂PO₄·7H₂O，1.4mmol/LKH₂PO₄)缓冲液，10000rpm，4℃离心10min，收集沉淀，加入DNA提取液提取总DNA；

c)以步骤b)中提取的总DNA为模板，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，以获得细菌16S rDNA。其中正向引物27F的5’-端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；

d)将步骤c)中得到PCR产物用纯化试剂盒按照使用说明进行纯化，纯化后利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；

e)将步骤d)中得到的纯化后的产物分别利用限制性内切酶Msp I和Rsa I消化，20μL中反应体系包括10×buffer 2μL，10μL PCR产物，Msp I或RsaI各10U(1μL)，加入灭菌双蒸水至20μL。37℃消化2h后65℃温育10min；

f)酶切产物进行T-RFLP分析，得到酒醅发酵过程T-RFLP图谱，经数据处理，获知白酒发酵过程中微生物动态变化和消长规律。

2.权利要求1的所述方法，其特征在于步骤a)中选择的样品是发酵不同天数的酒醅。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述酒醅取样量0.5～2.0g，缓冲液用量2.0～6.0mL。

4.权利要求2所述的方法，其特征在于所述取样量优选1.0g，缓冲液用量优选6.0mL。

5.权利要求1的方法，其特征在于步骤c)中正向引物27F的5’端使用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中PCR扩增采用降落PCR(TOUCHDOWN)策略：预变性条件为94℃10min，前20个循环为94℃1min、65℃～55℃1min和72℃1.5min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，后10个循环为94℃1min、55℃1min和72℃3min，最后在72℃下延伸7min。