[发明专利]一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法

说明书

技术领域

T-RFLP技术属于微生物生态学领域，在传统发酵食品中常被用于菌株鉴定、对比分析不同生态环境微生物多样性、评估复杂微生物群落多样性、发酵过程微生物动态消长等研究。

背景技术

末端限制性片段长度多样性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP)是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征、菌种鉴定等多方面。

T-RFLP技术的原理是根据研究目的和微生物群落的特点，选择一段具有系统进化标记特征的DNA序列为目的片段，根据目标基因序列上的保守区设计引物，在其中一个引物的5’末端用荧光物质标记，采集样品后提取微生物的总DNA，以总DNA为模板进行PCR扩增，所得的PCR产物的一端就带有荧光标记，利用合适的限制性内切酶进行酶切，不同微生物目标DNA片段因其核苷酸序列不同导致其酶切位点存在差异，酶切后产生许多不同长度的限制性片段。将酶切产物用自动测序仪进行电泳分离和荧光检测，只有末端带荧光标记的片段(T-RFs)能被检测到，而其他没有带荧光标记的片段则检测不到。由于核苷酸序列具有多态性，即不同微生物同一基因的DNA片段在相同条件下酶切后得到长度不同的T-RFs，反映在T-RFLP检测中就是不同的荧光信号，荧光强度的大小可以确定菌种的丰度。通过对这些荧光信号以及由此生成的T-RFLP图谱的分析，根据不同长度的末端限制性片段至少代表一种微生物种类，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况，还可根据已知序列鉴定到种。

与其他分子指纹图谱技术相比，T-RFLP具有以下优势，1)操作简单，高通量，能够迅速产生大量重复、精确的数据，非常适合微生物群落时空变化研究；2)易于实现自动化，输出的数据能够进行快速分析；3)根据T-RFs的长度，与现有数据库比对，有可能直接鉴定群落图谱中的单个菌种；4)精密度和分辨率较高。

中国传统固态发酵蒸馏酒的生产是包括了环境、糖化发酵剂等中的微生物菌群相互迁徙以及在发酵过程中动态演化、交替并最终趋于稳定的动态平衡过程。白酒发酵过程微生物群落是整个白酒酿造微生物生态系统的重要组成部分，微生物群落消长变化引起发酵过程物质能量变化，同时物质能量变化又反作用于微生物群落，这种相互作用的不断交替进行是中国传统固态法白酒的典型特征风味形成的重要物质基础。

研究白酒发酵过程中微生物群落的变化规律有助于加强对白酒特征风味形成机理的认识和理解，为提高产品质量和改良酒体风格提供理论依据。由于白酒发酵过程中微生物之间作用机理非常复杂，而以往研究方法多沿用平板分离法，改变了样品中微生物群落组成，无法分析微生物与环境的相互关系，得到的只是可培养的那部分微生物信息，并且工作量大，操作繁琐。应用T-RFLP分析白酒发酵过程微生物群落结构多样性能够克服传统培养方法的局限，可以快速得到白酒发酵过程中微生物群落结构多样性信息和动态演变规律。

发明内容

本发明的目的是针对白酒发酵过程微生物群落结构多样性现有研究方法存在的问题，为解决部分微生物由于不可分离性造成难以直接研究的技术难题以及快速认识和了解白酒发酵过程中微生物动态变化规律，而提供的一种研究白酒发酵过程中微生物群落结构多样性的方法。

本发明的具体方案如下：

a)从某固态法白酒厂分别在发酵第1、3、7、10、15、21、28d时取酒醅样，酒醅取样后分别放置无菌离心管中，-20℃保存；

b)取0.5～2.0g酒醅样品加2～6.0mL 1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L NaH₂PO₄·7H₂O，1.4mmol/LKH₂PO₄)缓冲液，10000rpm，4℃离心10min，收集沉淀，加入DNA提取液提取总DNA；

c)以步骤b)中提取的总DNA为模板，采用通用引物扩增细菌16S rDNA。正向引物为27F，反向引物为1492R，其序列分别为：27F：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R：(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，正向引物27F的5’-端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；