[发明专利]具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

    本发明涉及一种基因重组方法制备具有抗纤溶酶活性的多肽textilinin-1。其关键是textilinin-1（Q8008）基因的密码子优化、合成、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。重组textilinin-1可以作为止血药，用于控制手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。

背景技术：

临床上，外科手术中如何减少血液的流失是需要密切关注的重要事件，尤其是对手术时间较长的心肺旁路手术，就更应该采取一定的措施，避免和减少患者的大量出血。减少外科手术中血液的用量能有效地降低因输血产生的大量问题和避免经血液传播疾病的感染，如乙型肝炎病毒，人免疫缺陷型病毒（HIV）和变型的克罗伊茨费尔特-雅各布病等。

止血药aprotinin（抑酞酶）在国外被常用于心脏外科手术中，主要用于体外循环下实施冠状动脉旁路移植术(CABG)的病人，以减少手术过程中的出血，并相应降低输血需求。但aprotinin有明显的副作用，可产生严重的不良反应，主要包括过敏性休克、心肌缺血、血栓形成、心力衰竭、肾功能异常、急性肾衰竭等，目前已经停止使用。

目前在国内还没有发现有同类产品的研究和报告。澳大利亚研究的textilinin-1仍处于实验室研究阶段。初步试验结果证明：textilinin-1与aprotinin相比，在相同用量的情况下，其止血过程更安全可靠。

textilinin-1（Txln-1），是一种Kunitz-型蛋白酶抑制剂，是从澳大利亚棕蛇Pseudonaja textilis textilis 中提取的，具有59个氨基酸，分子量为6.7 kDa的多肽。这个分子被建议作为在外科手术中aprotinin的替代药物。虽然textilinin-1与aprotinin在蛋白序列上相似度只有47%。但在这两种多肽中，六对二硫键是高度保守的。因此，预期他们的分子空间折叠是相似的，只是分子表面特性有些不同。

textilinin-1 和aprotinin都具有强烈地抑制plasmin、elastase和trysin活性的作用。研究发现aprotinin对urokinase，thrombin和kallikrein比textilinin-1强。被textilinin-1抑制的plasmin将很快地被逆转，并比aprotinin易于控制，这可有助于控制血浆和损伤部位的抗纤维蛋白溶解活性。textilinin-1的这一特点降低了由于强烈抑制纤溶酶（aprotinin）而导致的血栓风险，使它成为减少手术中血液损失的安全治疗性药物。并且，由于textilinin-1相对于plasmin有更强的专一性，可以在较高的剂量使用而没有由于酶特异性差而导致的安全风险。与主要用于心脏外科手术中aprotinin相比，Textilinin-1可能作为更可靠和更安全的止血用药。

textilinin-1可引起预期的血块溶解抑制作用。在同样的摩尔浓度下，aprotinin的抑制作用显著低于textilinin-1。这也是早期用血浆凝块溶解实验所证明的。textilinin-1可抑制纤溶酶活性，并在小动物模型中能减少出血。textilinin-1同aprotinin一样，在5微摩的浓度下就能产生几乎完全抑制tPA诱导产生的全血凝块纤维蛋白的溶解。aprotinin能显著增加血浆aPTT，而血浆aPTT则不受textilinin-1的影响。在小鼠尾静脉出血动物模型中，静脉给药，textilinin-1和aprotinin都能起到相同的减少血液损失的作用。但textilinin-1可使小鼠止血时间更短。说明textilinin-1值得进一步研究，有望开发成为替代aprotinin的药物。