[发明专利]一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病检测，具体涉及一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪伪狂犬病毒抗体的阻断ELISA检测方法。适用于检测猪血清中的伪狂犬病毒抗体水平。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失，猪是本病的天然宿主和储存者。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在伪狂犬病的防制工作中，监测和检测猪血清中伪狂犬病病毒抗体的水平是非常重要的一个环节。对于尚未接种的猪只，血清中的猪伪狂犬病病毒抗体既可能反映了母源抗体的影响，也可能反映了隐性感染的迹象。这两种情况都会影响到减毒活疫苗的接种效果，甚至可能使疫苗无效，无法产生对病毒的免疫保护，导致免疫失败。对于已经接种的猪只，血清中的猪伪狂犬病病毒抗体水平则反映了免疫的效果。

目前国内检测猪伪狂犬病毒抗体一般采用乳胶凝集、间接ELISA方法等，这些方法敏感性不高，对抗原纯度要求却比较高，而真正意义上的纯抗原很难获得。因此不可避免会产生非特异性反应，对结果造成误判。

本发明应用针对伪狂犬病毒的单克隆抗体及阻断ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的优点是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的的单克隆抗体，提高了检测的灵敏性和特异性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒抗体的检测方法。该方法将猪伪狂犬病毒作为抗原包被于ELISA板上，然后加待检血清孵育，再加入酶标记的猪伪狂犬病毒单抗，显色时应出现两种情况，如果待检血清是阳性，那么此时加入的酶标单抗就会被阳性血清中的抗体阻断，酶标仪检测数值就会越低。如果是待检血清阴性，那么酶标单抗就会继续与ELISA板上猪伪狂犬病毒抗原反应，得到的数值就会越高。其检测方法特异性好、敏感性高。与美国IDEXX公司猪伪狂犬抗体ELISA试剂盒的检测符合率为97％。有着良好的应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种检测猪伪狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株(该伪狂犬病毒鄂A株来源见参考文献：陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998年02期)。

所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、洗涤液、终止液。

所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用0.1mol/L，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的阳性对照为猪伪狂犬疫苗免疫的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清。

所述的洗涤液为含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液；所述终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液。

所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。

所述的样品稀释液液为含2.5mg/mL的明胶的DMEM培养基。

所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的猪伪狂犬病毒(鄂A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用纯化的猪伪狂犬病毒包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬疫苗免疫的猪阳性对照血清和未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为PRV-GB。

一种猪伪狂犬病毒抗体的阻断ELISA检测方法，其步骤是：

1)从试剂盒中取出预包被有病毒抗原的检测板(根据样品多少，可拆开分次使用)，将稀释好的待检血清(1∶1稀释)100μL加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100μL。

2)轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育30分钟。甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干。