[发明专利]一种PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及其应用方法。 

背景技术

尿酸酶又称尿酸氧化酶(Uricase，Urate Oxidase，EC 1.7.3.3，UO)，能催化尿酸氧化生成尿囊素、CO₂和H₂O₂。大多数脊椎动物的肝脏、肾脏等组织中均发现有此酶的存在，但人类及一些灵长类动物由于基因突变失去合成有活性尿酸氧化酶的能力[1]。 

尿酸是人体内嘌呤分解代谢的最终产物，由肾脏排泄，随尿液排出体外。尿酸在体内主要以钠盐形式存在，自由形式的尿酸极其钠盐在水中溶解度很低。如果体内嘌呤代谢紊乱产生过量尿酸，或尿酸排泄受阻，都能使血液中尿酸浓度升高，从而引起高尿酸血症和痛风等疾病。恶性血液疾病和肿瘤化疗也会导致血液尿酸浓度升高。 

高尿酸血症和痛风不仅能引起关节肿胀，还可诱发和加重脂类代谢紊乱、糖尿病，增加心脑血管疾病、代谢紊乱综合症及肾脏疾病病人的死亡率。近些年来，随着我国人民生活方式和饮食结构的变化，痛风病患病者迅速增加，并呈现年轻化的趋势。患病率高达约4％，接近欧美等发达国家水平，已成为严重威胁我国人民健康的常见病、多发病。 

目前，对于痛风病的治疗，一般使用促进尿酸排泄或抑制尿酸合成的药物。排尿酸药有丙磺舒类药物，通过抑制肾小管对尿酸重吸收，增加其排泄。抑制尿酸合成的主要药物是别嘌呤醇。它是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂，能抑制 黄嘌呤氧化成尿酸，使得尿酸合成减少。但它可造成尿酸的前体物黄嘌呤浓度升高。而黄嘌呤的水溶性比尿酸更低，有些病人会发生黄嘌呤肾损伤和沉积。别嘌呤醇和丙磺舒类药物都有明显肝肾毒性，且疗效都不够理想[2]。 

尿酸氧化酶是治疗常规疗法无效的痛风病患者的理想药物。人体内尿酸氧化酶基因中存在2处致死性突变，它们分别位于尿酸氧化酶氨基酸序列的第33位和第187位氨基酸残基，由精氨酸残基变为终止密码(CGA→TGA)。为了得到一种适于人类使用的尿酸氧化酶制剂，本发明使用一段与人类基因比较相似且有较好活力的猪尿酸氧化酶的基因取代人类基因中的无功能部分，制备出猪-人尿酸氧化酶嵌合基因，使用该基因生产制备可用于临床的猪-人尿酸氧化酶融合蛋白。 

临床观察显示，如果蛋白类药物多次给药，其药效往往难以维持。其原因是蛋白质本身就是天然抗原，注射到体内后会刺激机体产生抗体，通过抗原抗体反应影响后期的治疗效果，严重时还会引起过敏反应。解决这一问题的有效途径之一就是对蛋白质进行聚乙二醇化(PEG化)修饰，以达到降低免疫原性，延长循环半衰期的目的。PEG是一种不带电荷的线性亲水分子，它可以与蛋白质的非必需基团共价结合形成空间构象上的屏障，避免外源蛋白的抗原决定簇诱导产生抗体。由于酶的底物多是小分子物质，可以穿过PEG屏障与活性部位结合，因此PEG化不会显著降低酶的活性。本发明涉及一种方法，能最大限度的屏蔽猪-人尿酸氧化酶的抗原性，并能很好的保存其酶活力，也有很高的生物安全性。 

发明内容

本发明的目的是提供PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法，和用PEG化重组猪-人尿酸氧化酶制备注射液和冻干粉针剂的方法，以及该注射液或 粉针剂在降低血尿酸含量中的应用。 

本发明还提供重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的载体，及包含该载体的宿主细胞。 

本发明的技术方案： 

一种PEG化的重组猪-人尿酸氧化酶，其特征在于该结合物包括重组猪-人尿酸氧化酶和PEG的共价连接物，二者通过氨基甲酸酯键形式共价连接；所述的重组猪-人尿酸氧化酶可以为四聚体；每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接8-12个PEG链，比较优选为9-11个PEG链，更优选为9-10个PEG链；所述的PEG可以为线形或分枝形，PEG的分子量可以为2-50KD，比较优选为5-20KD，更优选为10KD；所述的重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列可以是序列表1中的序列，其氨基酸序列可以是序列表2中的序列。 

一种降低血浆尿酸含量的组合物，其特征在于包括所述的重组猪-人尿酸氧化酶与PEG的结合物和药学上可接受的载体。该组合物的给药途径包括肌肉注射，静脉注射，痛风红肿部位或痛风石所在部位局部注射等；该组合物可以以注射液或冻干粉针等制剂形式存在。 

所述的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶以及包含该结合物的药物组合物可以在制备用于降低血浆尿酸含量的药物中应用，可用于临床上高尿酸血症的治疗和痛风病的全身和局部治疗。